（貨號(hào)：WLRB8207KIT）
原理概述：
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在恒溫條件下（42 °C），特殊修飾的反轉(zhuǎn)錄酶利用特異性引物DNA和模板RNA合成cDNA鏈，反應(yīng)體系中的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進(jìn)行快速核酸擴(kuò)增反應(yīng)。適用于實(shí)驗(yàn)室級(jí)別的RNA擴(kuò)增以及其他檢測(cè)用途的RNA擴(kuò)增使用。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短（僅需30 mins）等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡(jiǎn)便，易于保存。
本試劑對(duì)設(shè)備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進(jìn)行反應(yīng)操作，無(wú)需購(gòu)買(mǎi)PCR擴(kuò)增儀等價(jià)格高昂的專屬設(shè)備。
引物設(shè)計(jì)：
建議使用長(zhǎng)度在 30-35 bp的引物，引物過(guò)短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度；引物設(shè)計(jì)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；擴(kuò)增子長(zhǎng)度建議在150-500 bp。
試劑盒組成：
| 組成 | 含量 |
| A buffer | 1.6 mL×1管 |
| B buffer | 150 μL×1管 |
| 試劑 | 48份 |
| 使用說(shuō)明書(shū) | 1份 |
試劑盒儲(chǔ)存：
運(yùn)輸條件：低溫運(yùn)輸；
儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓和反復(fù)凍融；
產(chǎn)品有效期：14個(gè)月。
操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。
1) 每個(gè)干粉反應(yīng)管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需融化混勻，否則會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)效果產(chǎn)生影響）；
2) 每個(gè)反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物和2 μL下游引物（引物濃度10 μM，對(duì)于多個(gè)反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；
3) 向反應(yīng)管中依次加入12.1 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為14.1 μL）;
4) 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（（請(qǐng)務(wù)必上下顛倒甩動(dòng)反應(yīng)管8-10次進(jìn)行混勻；對(duì)于多個(gè)反應(yīng)，建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)上下顛倒后混勻）；
5) 混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中42 oC孵育30 mins；
6) 反應(yīng)結(jié)束后，加入Tris飽和酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）抽提液，1:1混勻抽提反應(yīng)液，12000 rpm離心5 mins，取5 μL上清進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。（注：不建議用高溫變性法去蛋白，高溫變性并不能起到有效去除蛋白的效果，還是會(huì)對(duì)電泳分析產(chǎn)物造成影響。也不推薦用市面上銷(xiāo)售產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化后再電泳。很多品牌的純化試劑盒無(wú)法達(dá)到預(yù)期效果，容易造成假陰性。）
體系配制
| 組分 | 體積（μL） |
| A buffer | 29.4 |
| 上游引物(10 μM) | 2 |
| 下游引物(10 μM) | 2 |
| ddH2O和RNA模板 | 14.1 |
| B buffer | 2.5 |
| 總體積 | 50 |
注意事項(xiàng)：
1． 由于試劑盒靈敏度非常高，在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免核酸污染，并設(shè)置空白對(duì)照；
2． 使用時(shí)請(qǐng)取出實(shí)驗(yàn)所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量，剩余部分請(qǐng)置于存儲(chǔ)條件下。
