（貨號(hào)：WLRB5001）
原理概述：
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下（42 °C），特殊修飾的反轉(zhuǎn)錄酶利用特異性引物DNA和模板RNA合成cDNA鏈，反應(yīng)體系中的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進(jìn)行快速核酸擴(kuò)增反應(yīng)。適用于實(shí)驗(yàn)室級(jí)別的RNA擴(kuò)增以及其他檢測(cè)用途的RNA擴(kuò)增使用。
引物設(shè)計(jì)：
建議使用長(zhǎng)度在30-35 bp的引物，引物過(guò)短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度；引物設(shè)計(jì)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；擴(kuò)增子長(zhǎng)度建議在150-300 bp，通常不超過(guò)500 bp。
試劑盒組成：
100T/盒
| 組成 | 含量 |
| C buffer | 1 mL×2管 |
| L buffer | 500 μL×1管 |
| PR-core | 1.2 mL×1管 |
| B buffer | 300 μL×1管 |
| 使用說(shuō)明書(shū) | 1份 |
試劑盒儲(chǔ)存：
運(yùn)輸條件：低溫運(yùn)輸；
儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復(fù)凍融；
產(chǎn)品有效期：儲(chǔ)存條件下，有效期6個(gè)月。
操作步驟：提前將試劑盒所需組分取出，冰上或低溫下融化（C buffer可室溫融化），震蕩混勻。
1) 向無(wú)菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer；
2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物，再加入1.5μL dNTPs(10 mM)；
3) 向反應(yīng)管中加入12 μL PR-core（步驟1~3可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；
4) 向反應(yīng)管中加入5 μL核酸模板；
5) 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（加入B buffer反應(yīng)立即被啟動(dòng)）；上下顛倒混勻后（請(qǐng)務(wù)必保證充分混勻），將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中：42 oC恒溫孵育，時(shí)間30 mins；
6) 反應(yīng)結(jié)束后，加入50 μL酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）抽提液，1:1混勻抽提反應(yīng)液，12000 rpm離心5 mins，取5 μL上清進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
體系配制
| 組分 | 體積（μL） |
| C buffer | 20
5 |
| L buffer | |
| PR-core | 12 |
| dNTPs(10 mM) | 1.5 |
| 下游引物(10 μM) | 2 |
| 下游引物(10 μM) | 2 |
| RNA模板 | 5 |
| B buffer | 2.5 |
| 總體積 | 50 |
|
注意事項(xiàng)：
- 為保證液體試劑組分活性，請(qǐng)保證儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 oC；試劑使用時(shí)請(qǐng)保持低溫，避免高溫放置過(guò)長(zhǎng)時(shí)間；
- 在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免微量核酸染，并設(shè)置空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)組。
