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【產(chǎn)品名稱】RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（試紙條型）-III【包裝規(guī)格】
貨號(hào)：WLRN8211KIT
規(guī)格：48份/盒
【原理概述】
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下（一般為39 oC~42 oC），反轉(zhuǎn)錄酶利用特異性引物和模板RNA合成cDNA鏈，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白的幫助下，重組酶和引物形成復(fù)合體；進(jìn)行同源搜索并結(jié)合目的同源域，此時(shí)在該同源位置形成D-loop區(qū)并開始進(jìn)行鏈交換；伴隨著重組酶從復(fù)合體上解離，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。依賴核酸酶的作用，加入根據(jù)模板設(shè)計(jì)的特異的分子探針，使用膠體金技術(shù)（三明治夾心法）可以對最終結(jié)果進(jìn)行檢測。
【產(chǎn)品特點(diǎn)】
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短（僅需15 min）等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡便，易于保存。
本試劑對設(shè)備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進(jìn)行反應(yīng)操作，無需購買PCR擴(kuò)增儀等價(jià)格高昂的專屬設(shè)備。
【引物設(shè)計(jì)】
建議使用長度在30-35 bp的引物，引物過短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測靈敏度；下游引物的5’端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)（常用）。引物設(shè)計(jì)避免形成二級結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；擴(kuò)增子長度建議在150-500 bp。
【熒光探針設(shè)計(jì)】
在上下游引物中間，設(shè)計(jì)一段長度為46-52nt
與目的片段互補(bǔ)的序列；5’端修飾一個(gè)抗原標(biāo)記（典型FAM）；在5’端和3’末端的中部位置標(biāo)記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)；3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-Spacer等。
【試劑盒組成】
組成 含量
A buffer 1.6 mL×1管
B buffer 150 μL×1管
試劑 48份
使用說明書 1份
注：考慮到核酸降解問題，RNA系列產(chǎn)品暫未提供正對照模板和引物探針。
【試劑盒儲(chǔ)存】
1．儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 °C恒溫環(huán)境，避光保存，避免重壓；
2．產(chǎn)品有效期：14個(gè)月；
3．生產(chǎn)日期見外包裝。
【操作步驟】
提前將試劑盒液體組分取出，室溫融化，震蕩混勻。
(1)每個(gè)干粉反應(yīng)管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需融化混勻，否則會(huì)對實(shí)驗(yàn)效果產(chǎn)生影響）；
(2)每個(gè)反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物、 2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個(gè)反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；
(3)向反應(yīng)管中依次加入5 μL 核酸模板和8.5 μL ddH2O （也可根據(jù)實(shí)際需求調(diào)整加入模板的體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為13.5 μL）；
(4)最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（注意：a. B buffer是啟動(dòng)反應(yīng)的緩沖液，一旦進(jìn)入體系意味著酶被激活；b. 請務(wù)必以上下顛倒甩動(dòng)反應(yīng)管8-10次的方式進(jìn)行混勻，渦旋、彈管子等方式可能無法有效混勻；c. 對于多個(gè)反應(yīng)，建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)，蓋好后上下顛倒后混勻，可保證反應(yīng)同時(shí)啟動(dòng)）；
(5)混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中40-42 oC孵育15min~20min；
(6)反應(yīng)結(jié)束后，用ddH2O將擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10～20倍，混合均勻后，進(jìn)行試紙條顯色，5 min內(nèi)觀察質(zhì)控線與檢測線判讀結(jié)果。
體系配制
組分 體積（μL）
A buffer 29.4
上游引物(10 μM) 2
下游引物(10 μM) 2
探針(10 μM) 0.6
ddH2O和核酸模板 13.5
B buffer 2.5
總體積 50
【注意事項(xiàng)】
1.使用前請仔細(xì)閱讀說明書，嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行操作；
2.樣品處理應(yīng)該嚴(yán)格按照生物安全規(guī)范操作，在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)請注意避免核酸污染，并設(shè)置空白對照；
3.使用時(shí)請取出實(shí)驗(yàn)所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量，剩余部分請置于存儲(chǔ)條件下；
4.使用有效期內(nèi)試劑，且各組分不得與其他批號(hào)的相應(yīng)成分混用。
