實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保溫7min。
3：結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
參數(shù)規(guī)格：

產(chǎn)品名稱：油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)cruciferin基因PCR試劑盒
貨號:CP96919
產(chǎn)品規(guī)格：50T
產(chǎn)品運(yùn)輸：低溫運(yùn)輸
產(chǎn)品保存：-20℃保存
產(chǎn)品有效期：一年
運(yùn)輸：低溫
注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

PCR檢測方法包括以下步驟：
(1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴(kuò)增檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2)待測樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。
其中步驟(1)為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴(kuò)增檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
其中所述參照基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴(kuò)增區(qū)域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題，提高HER2基因擴(kuò)增檢測的可靠性。
步驟(2)為：待測樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。
其中所述待測目的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴(kuò)增區(qū)域，所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增方法，所述熒光定量PCR擴(kuò)增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴(kuò)增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴(kuò)增。
使用方法:
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，*用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽性對照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對照管。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個(gè)用于PCR 陽性對照。

以下是油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)cruciferin基因PCR試劑盒公司正在熱銷的產(chǎn)品：
Human TNFRSF6B(Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B) ELISA Kit資源名稱柿苗擬莖點(diǎn)霉種屬:Phomopsis│rojana Gaja分離基物:柿

Human PDE10A(cAMP and cAMP-inhibited cGMP 3',5'-cyclic phosphodiesterase 10A) ELISA Kit資源名稱地錘菌屬種屬:Cudonia│claves提供形式:斜面培養(yǎng)物

Human MTBP(Mdm2-binding protein) ELISA Kit資源名稱茄腐皮鐮刀菌種屬:Haematonectria│haematococca (Berk. & Broome) Samuels & Rossman提供形式:斜面培養(yǎng)物

Human PPARGC1A(Peroxisome prolifeRator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) ELISA Kit資源名稱褐赤刺革菌種屬:Hymenochaete│rubiginosa (Dicks.) Lév.提供形式:斜面培養(yǎng)物

Human SLC26A4(Pendrin) ELISA Kit資源名稱肉座菌屬種屬:Hypocrea│sp.提供形式:斜面培養(yǎng)物

Human TXNIP(Thioredoxin-interacting protein) ELISA Kit資源名稱摩洛哥芽孢桿菌種屬:Bacillus│maroccanus Delaporte and Sasson 1967分離基物:轉(zhuǎn)基因銀中楊根圈土壤

Human TSTA3(GDP-L-fucose synthase) ELISA Kit資源名稱滑子蘑種屬:Pholiota│nameko (T. Ito) S. Ito & S. Imai提供形式:斜面培養(yǎng)物

Human B3GALT1(Beta-1,3-galactosyltransferase 1) ELISA Kit資源名稱黃白側(cè)耳種屬:Pleurotus│cornucopiae (Paulet) Rolland提供形式:斜面培養(yǎng)物

Human TTF1(Transcription Termination Factor, RNA polymerase I) ELISA Kit資源名稱銳齒櫟蛙眼種屬:Macrophoma│fusispora Bub.分離基物:水杉

Human B3GALT2(Beta-1,3-galactosyltransferase 2) ELISA Kit資源名稱色二孢種屬:Diplodia│mangiferae Koord.分離基物:芒果

Human DNM2(Dynamin-2) ELISA Kit資源名稱長根小奧德蘑鱗柄變種種屬:Oudemansiella│radicata var. furfuracea (Perk) Pegler et Young提供形式:斜面培養(yǎng)物

Human C19orf80(Betatrophin) ELISA Kit資源名稱粗柄側(cè)耳(俗名：北風(fēng)菌)種屬:Pleurotus│platypus (Cooke et Massee) Sacc.提供形式:斜面培養(yǎng)物

Human TWIST1(Twist-related protein 1) ELISA Kit資源名稱青霉種屬:Penicillium│sp.分離基物:植物根際

Human TXK(Protein tyrosine kinase 4) ELISA Kit資源名稱*蟬花1-5種屬:Isaria│cicadae Miq.分離基物:子實(shí)體

Human TXNDC5(Thioredoxin domain-containing protein 5) ELISA Kit資源名稱金黃殼囊孢菌種屬:Cytospora│chrysosperma (Pers.) Fr.分離基物:山楊樹皮

Human SFRP1(Secreted frizzled-related protein 1) ELISA Kit資源名稱黃絮鱗鵝膏菌種屬:Amanita│chrysoleuca Pegler分離基物:組織塊

Human BAI3(Brain-specific angiogenesis inhibitor 3) ELISA Kit資源名稱白乳菇種屬:Lactarius│piperatus (L.) Pers.分離基物:組織塊

Human HTT(Huntingtin) ELISA Kit資源名稱黑根須腹菌種屬:Rhizopogon│piceus Berk. & M.A. Curtis分離基物:組織塊

Human IDH1(IsocitRate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic) ELISA Kit資源名稱正紅菇種屬:Russula│vinosa Lindblad分離基物:組織塊

Human CRHR1(Corticotropin-releasing factor receptor 1) ELISA Kit資源名稱素馨生棒孢種屬:Corynespora│jasminicola Meenu Kharwar & Bhartiya分離基物:金葉女貞葉片
油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)cruciferin基因PCR試劑盒TFF3(Trefoil factor 3)|ITF|TFI|trefoil factor 3(intestinal)結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)用途：結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂用于水或食品中大腸菌群平板菌落計(jì)數(shù)(GB4789.3-2010和SN0169-92)。原理：

TFPI(Tissue Factor Pathway Inhibitor)|EPI|LACI|TFI|TFPI1|lipoprotein-associated coagulation inhibitor煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)用途：煌綠乳糖膽鹽肉湯用于多管發(fā)酵法測定大腸菌群的確證試驗(yàn)(GB4789.3-2010和SN0169-92)。原理：

TGF-α(Transforming Growth Factor α)|TGFα|TGFA|protransforming growth factor alpha改良月桂基硫酸鹽胰蛋白月示肉湯(MLST)用途：用于奶粉中阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)的增菌和分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法(PCR)選擇性增菌(GB4789.40-2010和SN1632.2-2005、ISO標(biāo)準(zhǔn))。原理：

TGFBI|βIG-H3(Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3)月桂基硫酸鹽胰蛋白胨-MUG肉湯用途：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨用于致病性大腸桿菌(包括O157：H7)的鑒別性試驗(yàn)(GB/T4789.36-2008和SN/T0973-2000)。原理：

TGFBR2(TGF-beta receptor type-2)|TGFR-2|AAT3|FAA3|HNPCC6|LDS1B|LDS2B|MFS2|RIIC|TAAD2|TbetaR-II|TGF-beta receptor type II|TGF-beta receptor type IIB|TGF-beta receptor type-2|TGF-beta type II receptor|TGFbeta-RII|TGFR-2|月桂基硫酸鹽胰蛋白月示肉湯(LST)用途：月桂基硫酸鹽胰蛋白月示肉湯用于多管發(fā)酵法測定大腸菌群和糞大腸菌群(GB4789.3-2010，GB/T4789.38-2008，GB/T4789.39-2008和SN0169-92，ISO)。原理：

TGF-β1(Transforming Growth Factor Beta 1)|TGF-B1|TGFB|TGFbeta|CED|DPD1|TGFβ1乳糖蛋白胨培養(yǎng)液用途：乳糖蛋白胨培養(yǎng)液用于水中多管發(fā)酵法或?yàn)V膜法測定大腸菌群(GB/T5750.12-2006和GB/T8538-2008)。原理：

TGF-β2(Transforming Growth Factor β2)|TGF-β2|TGFβ2|TGFB2|BSC-1 cell growth inhibitor|Cetermin|G-TSF|Polyergin|polyergin|TGF-beta2|TGF-beta-2|transforming growth factor beta-2亮綠乳糖培養(yǎng)液(BGB)用途：亮綠乳糖培養(yǎng)液用于多管發(fā)酵法測定飲用礦泉水中大腸菌群的確證試驗(yàn)(GB/T8538-2008)。原理：

TGF-β3(Transforming Growth Factor Beta 3)|TGFB3|ARVD|FLJ16571|TGF-beta3|TGF-beta-3|transforming growth factor beta-3|transforming growth factor|beta 3四環(huán)素檢定培養(yǎng)基用途：四環(huán)素檢定培養(yǎng)基用于四環(huán)素族殘留的一種微生物學(xué)檢定（GB/T9695.16-88和SN0179-92）。原理：