使用方法:
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例)。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,*用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 陽(yáng)性對(duì)照(濃度為 1×10E8 拷貝/μL,試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的 DNA,本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8. 如果有 N 個(gè)樣品,則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取,多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)(20μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行)
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用水做模板),6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管,其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用水做模板),1 個(gè)用于PCR 陽(yáng)性對(duì)照。
參數(shù)規(guī)格:
產(chǎn)品名稱:轉(zhuǎn)基因品系大豆GU262探針法qPCR試劑盒
貨號(hào):CP96975
產(chǎn)品規(guī)格:50T
產(chǎn)品運(yùn)輸:低溫運(yùn)輸
產(chǎn)品保存:-20℃保存
產(chǎn)品有效期:一年
運(yùn)輸:低溫
注意事項(xiàng):1.基礎(chǔ)程序;2.?dāng)U增溫度和延伸溫度;3.反應(yīng)時(shí)間;4.循環(huán)次數(shù);5.PCR 反應(yīng)液的配制;6.PCR技術(shù)的基本原理;7.PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué);8.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;9.PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。
PCR檢測(cè)方法包括以下步驟:
(1)將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接,克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上,構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品,并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線;
(2)待測(cè)樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后,目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù),計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值,即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。
其中步驟(1)為:將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接,克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上,構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品,并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
其中所述參照基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)參照基因,較佳地管家基因,優(yōu)選地為RPPH1的擴(kuò)增區(qū)域,其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體,較佳地為PCR克隆載體,優(yōu)選地為TA cloning載體,所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1:1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測(cè)目的基因與參照基因的比例為1:1,解決了目前相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題,提高HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)的可靠性。
步驟(2)為:待測(cè)樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后,目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù),計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值,即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。
其中所述待測(cè)目的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)待測(cè)目的基因,較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因,更佳地為HER2基因的擴(kuò)增區(qū)域,所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增方法,所述熒光定量PCR擴(kuò)增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴(kuò)增,更佳地為雙通道熒光定量PCR擴(kuò)增。
?實(shí)驗(yàn)方法步驟:
方法
1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋,不加或添加石蠟油。
2:調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,在72℃ 保溫7min。
3:結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4:PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
以下是轉(zhuǎn)基因品系大豆GU262探針法qPCR試劑盒公司正在熱銷的產(chǎn)品:
Human POTE-E(POTE-E(POTE Ankyrin Domain Family Member E)) ELISA Kit資源名稱鴨疫里氏桿菌種屬:Riemerella│anatipestifer分離基物:鴨心血
Human FDP(Fibrinogen Degradation Product) ELISA Kit資源名稱乳房鏈球菌種屬:Streptococcus│uberis分離基物:患病奶牛
Human POTE-D(POTE-D(POTE Ankyrin Domain Family Member D)) ELISA Kit資源名稱氏桿菌種屬:Pasteuerlla│gallinarum分離基物:水牛
Human FETUB(Fetuin B) ELISA Kit資源名稱牛溶血鏈球菌種屬:Streptococcus│bovis分離基物:牛
Human fFDFT1(Farnesyl Diphosphate Farnesyltransferase 1) ELISA Kit資源名稱山羊葡萄球菌種屬:Staphylococcus│caprae分離基物:羊
Human FG(Fibrinogen) ELISA Kit資源名稱豬葡萄球菌種屬:Staphylococcus│hyicus分離基物:豬心
Human FGF23(Fibroblast Growth Factor 23) ELISA Kit資源名稱非洲馬瘟病毒(VI型)種屬:類戊肝病毒屬│提供形式:凍干物
Human FGFR2(Fibroblast Growth Factor Receptor 2) ELISA Kit資源名稱非洲馬瘟病毒(IX型)種屬:類戊肝病毒屬│提供形式:凍干物
Human FGFR3(Fibroblast Growth Factor Receptor 3) ELISA Kit資源名稱流產(chǎn)布魯氏菌 生物Ⅵ型種屬:Brucella│abortus BiovarⅥ提供形式:凍干物
Human FGFR4(Fibroblast Growth Factor Receptor 4) ELISA Kit資源名稱Alternaria angustiovoidea種屬:Alternaria│angustiovoidea分離基物:莖
Human FGL1(Fibrinogen Like Protein 1) ELISA Kit資源名稱Amycolatopsis keratiniphila subsp. nogabecina種屬:Amycolatopsis│keratiniphila subsp. nogabecina提供形式:凍干物
Human FGL2(Fibrinogen Like Protein 2) ELISA Kit資源名稱Chlamydomyces palmarum種屬:Chlamydomyces│palmarum分離基物:根
Human FGα(Fibrinogen Alpha) ELISA Kit資源名稱Mycetocola reblochoni種屬:Mycetocola│reblochoni提供形式:凍干物
Human FGβ(Fibrinogen Beta) ELISA Kit資源名稱Myrmecridium sp.種屬:Myrmecridium│sp.提供形式:斜面培養(yǎng)物
Human f-Hb(Free Haemoglobin) ELISA Kit資源名稱Pestalotiopsis cocculi種屬:Pestalotiopsis│cocculi分離基物:根
Human FLNα(Filamin A, Alpha) ELISA Kit資源名稱Tritirachium roseum種屬:Tritirachium│roseum分離基物:土壤
Human FLOT2(Flotillin 2) ELISA Kit資源名稱暗灰色馬杜拉放線菌種屬:Actinomadura│atramentaria提供形式:凍干物
Human Flt3L(FMS Like Tyrosine Kinase 3 Ligand) ELISA Kit資源名稱棒狀鏈霉菌種屬:Streptomyces│clavuligerus提供形式:斜面培養(yǎng)物
Human FOXC1(Forkhead Box Protein C1) ELISA Kit資源名稱北里孢菌屬種屬:Kiatasatospora│griseola提供形式:斜面培養(yǎng)物
Human ITG αⅤβ3(Integrin αⅤβ3) ELISA Kit資源名稱草色串孢種屬:Torula│herbarum分離基物:植物殘?bào)w
轉(zhuǎn)基因品系大豆GU262探針法qPCR試劑盒CTAG| CTAG1| ESO1| LAGE2| LAGE2A| Cancer/testis antigen 6.1| L antigen family member 2形態(tài)特性 上皮細(xì)胞生長(zhǎng)特性 貼壁生長(zhǎng)特征特性 CSAp陰性(CSAp-)。 結(jié)腸抗原3,陰性。 角蛋白免疫過氧化物酶染色陽(yáng)性。 癌基因c-myc, K-ras, H-ras, myb, sis 和fos的表達(dá)呈陽(yáng)性。 未檢測(cè)到癌基因N-myc和N-ras的表達(dá)。 表達(dá)腫瘤特異的核基質(zhì)蛋白CC-4,CC-5和CC-6。 培養(yǎng)條件 L15: Leibovitz Medium 優(yōu)質(zhì)胎牛血清,10%
HSP-40(Heat Shock Protein 40)|DNAJB1|Hdj1|HSPF1|DnaJ(Hsp40) homolog|subfamily B|member 1|dnaJ homolog subfamily B member 1|DnaJ protein homolog 1|DNAJ1|hDj-1|Heat shock 40 kDa protein 1|HSP40|Human DnaJ protein 1|radial spoke 16 homolog B|RSPH16B|Sis1形態(tài)特性 上皮細(xì)胞生長(zhǎng)特性 貼壁生長(zhǎng)特征特性 C-33 A 細(xì)胞株是N. Auersperg從宮切片中建立的一系列細(xì)胞株(參見ATCC CRL-1594和ATCC CRL-1595)中的一株。 細(xì)胞一開始就表現(xiàn)出亞二倍體核型及上皮細(xì)胞形態(tài)。 連續(xù)傳代可以觀察到核型不穩(wěn)定。 存在成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(pRB),但大小不正常。 P53表達(dá)上調(diào),且有一個(gè)273位密碼子的點(diǎn)突變導(dǎo)致Arg -> Cys的替換。 人瘤病毒DNA及RNA陰性。 培養(yǎng)條件 MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle's Balanced Salts) 優(yōu)質(zhì)胎牛血清,10%
OGFR| opioid growth factor receptor|Protein 7 60| Zeta type opioid receptor形態(tài)特性 上皮細(xì)胞生長(zhǎng)特性 貼壁生長(zhǎng)特征特性 這株細(xì)胞來源于一個(gè)細(xì)胞集落不規(guī)則沒有顯著角質(zhì)化的侵染性鱗狀細(xì)胞癌。 單層培養(yǎng)的細(xì)胞間可以觀察到帶狀連接,也注意到有細(xì)胞質(zhì)張力絲。 1970年發(fā)現(xiàn)支原體污染并去除。 腫瘤壞死因子(TNF)α抑制ME-180的生長(zhǎng)。 這株細(xì)胞含有人瘤病毒(HPV)DNA,與HPV-39的同源性高于HPV-18。 培養(yǎng)條件 McCoy's 5A Media (Modified with Tricine) 優(yōu)質(zhì)胎牛血清,10%
CALCB(Calcitonin gene-related peptide 2)|CALC2|Beta-CGRP|CGRP-II|Beta-type CGRP|Calcitonin gene-related peptide II形態(tài)特性 上皮細(xì)胞生長(zhǎng)特性 貼壁生長(zhǎng)特征特性 這株細(xì)胞是J. Sykes于1974年建立的(參考ATCC HTB-33)。 有報(bào)告稱MS751細(xì)胞含有人狀瘤病毒18 (HPV-18)序列。 [22995] [23180] 后來發(fā)現(xiàn)MS751細(xì)胞包含HPV-45基因組的一部分,而其中E6/E7區(qū)域表達(dá)呈poly(A)+RNA的形式。 [49721] 培養(yǎng)條件 MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle's Balanced Salts) 優(yōu)質(zhì)胎牛血清,10%
AMY||NOEL1|Noelin|NOELIN1|OlfA|olfactomedin 1|OLFM1形態(tài)特性 上皮細(xì)胞樣生長(zhǎng)特性 貼壁生長(zhǎng)特征特性 人肝膽管癌細(xì)胞。據(jù)說產(chǎn)CEA和CA19-9。 培養(yǎng)條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 優(yōu)質(zhì)胎牛血清,10%
BHLHB1| bHLHe19| OLIG2| OLIGO2| PRKCBP2| RACK17形態(tài)特性 上皮細(xì)胞樣生長(zhǎng)特性 貼壁生長(zhǎng)特征特性 據(jù)報(bào)道產(chǎn)球蛋白和甲胎蛋白。 培養(yǎng)條件 DMEM-H: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DME H-21 4.5g/Liter Glucose) 優(yōu)質(zhì)胎牛血清,10%
INSR|CD220|CD220 antigen|HHF5|insulin receptor|IR形態(tài)特性 上皮細(xì)胞樣生長(zhǎng)特性 貼壁生長(zhǎng)特征特性 人肝癌細(xì)胞株。這株細(xì)胞從裸鼠體外移植瘤中建立。 培養(yǎng)條件 RPMI 1640 (w/o Hepes) 優(yōu)質(zhì)胎牛血清,10%
HABP1|C1QBP(Hyaluronan Binding Protein 1)|gC1qBP|gC1qR|SF2p32|p32|Glycoprotein gC1qBP|HABP1p33|GC1q-R protein|C1q globular domain-binding protein|gC1Q-R|Hyaluronan-binding protein 1|Mitochondrial matrix protein p32|splicing factor SF2-associated protein形態(tài)特性 上皮細(xì)胞生長(zhǎng)特性 貼壁生長(zhǎng)特征特性 SK-OV-3由G.Trempe和L.J.Old在1973年從卵巢腫瘤病人的腹水分離得到。 此細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子和幾種細(xì)胞毒性藥物包括白喉毒素、順鉑和阿霉素均耐受。 在裸鼠中致瘤,且形成與卵巢原位癌一致的中度分化的腺癌。 培養(yǎng)條件 McCoy's 5A Media (Modified with Tricine) 優(yōu)質(zhì)胎牛血清,10%