細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

產(chǎn)品屬于：

產(chǎn)品名稱：原代間充干細胞無血清培養(yǎng)體系    

產(chǎn)品規(guī)格：100ml/500ml

貨號：FS-01X9956

保存溫度（℃）：2-8℃/-20℃

運輸溫度（℃）：2-8℃/-20℃   

細胞培養(yǎng)的優(yōu)點：

注意事項：

 Interleukin 7 (IL7)白介7(IL7)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Toll Like Receptor 2 (TLR2)Toll樣受體2(TLR2)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Toll Like Receptor 6 (TLR6)Toll樣受體6(TLR6)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Myeloid Progenitor Inhibitory Factor 2 (MPIF2)髓樣前體細胞抑制因子2(MPIF2)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Dopamine Receptor D5 (DRD5)多巴受體D5(DRD5)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Calcineurin (CaN)鈣調(diào)磷(CaN)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Caspase 12 (P12)胱天蛋白12(P12)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Heat Shock Transcription Factor 4 (HSF4)熱休克轉(zhuǎn)錄因子4(HSF4)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Pyruvate Dehydrogenase Kinase Isozyme 4 (PDK4)丙脫氫激同工4(PDK4)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Procollagen I N-Terminal Propeptide (PINP)Ⅰ型前膠原基端原(PⅠNP)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Retinoic Acid Receptor Alpha (RARa)維甲受體α(RARα)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Phosphatidylglycerol (PG)磷脂酰甘油(PG)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Phosphatidic Acid (PA)磷脂(PA)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Interleukin 1 Beta (IL1b)白介1β(IL1β)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Immunoglobulin A (IgA)免疫球蛋白A(IgA)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Signal Transducer And Activator Of Transcription 6 (STAT6)信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子6(STAT6)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Signal Transducer And Activator Of Transcription 5A (STAT5A)信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子5A(STAT5A)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Signal Transducer And Activator Of Transcription 4 (STAT4)信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T
原代間充干細胞無血清培養(yǎng)體系DHRS2  脫氫/還原家族成員2抗體規(guī)格: 0.2ml

ox-LDL  氧化低密度脂蛋白抗體規(guī)格: 0.1ml

FSIP1  纖維性鞘結(jié)合蛋白1抗體規(guī)格: 0.2ml

GNRPX/PLEKHJ1  鳥核結(jié)合蛋白X抗體規(guī)格: 0.2ml

GPKOW  G蛋白修補結(jié)構(gòu)域蛋白5抗體規(guī)格: 0.2ml

GRAMD2  GRAM結(jié)構(gòu)域蛋白2抗體規(guī)格: 0.2ml

PMS1  腫瘤錯配修復(fù)基因PMS1抗體規(guī)格: 0.1ml

GRAMD3/NS3TP2  丙型肝炎病毒-NS3反轉(zhuǎn)錄激活蛋白2抗體規(guī)格: 0.2ml
實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。