細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

產(chǎn)品屬于：

產(chǎn)品名稱：DMEM（無酚紅）基礎(chǔ)培養(yǎng)基    

英文名稱：DMEM（無酚紅）

貨號：FS-01X9987

產(chǎn)品規(guī)格：500ml   

細胞培養(yǎng)的優(yōu)點：

注意事項：

 High Molecular Weight Kininogen (HMWK)YAC-1細胞，淋巴瘤細胞規(guī)格：48T/96T

 Mucin 2 (MUC2)粘蛋白2(MUC2)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Mucin 7, Secreted (MUC7)粘蛋白7(MUC7)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Membrane Protein, Palmitoylated 2 (MPP2)棕櫚?；さ鞍?(MPP2)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Alcohol Dehydrogenase 1 (ADH1)乙脫氫1(ADH1)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Selenoprotein P1, Plasma (SEPP1)硒蛋白P1(SEPP1)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Vitamin D Binding Protein (DBP)維生D結(jié)合蛋白(DBP)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Clusterin (CLU)簇集蛋白(CLU)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Uridine Phosphorylase 1 (UPP1)核磷化1(UPP1)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Alkaline Phosphatase, Liver/Bone/Kidney (ALPL)肝腎骨堿性磷(ALPL)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Beta-Site APP Cleaving Enzyme 2 (bACE2)β-位淀粉樣前體蛋白裂解2(βACE2)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Beta-Site APP Cleaving Enzyme 2 (bACE2)β-位淀粉樣前體蛋白裂解2(βACE2)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Plasminogen (Plg)纖溶原(Plg)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Interleukin 6 Receptor (IL6R)白介6受體(IL6R)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Parathyroid Hormone (PTH)甲狀旁腺(PTH)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Versican (VS)多功能蛋白聚糖(VS)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 (VEGFR1)血管內(nèi)皮生長因子受體1(VEGFR1)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T

 V-Jun Sarcoma Virus 17 Oncogene Homolog (JUN)V-Jun肉瘤病毒癌基因同源物(JUN)檢測試劑盒(聯(lián)免疫吸附試驗法)規(guī)格：48T/96T
DMEM（無酚紅）基礎(chǔ)培養(yǎng)基RNF44  環(huán)指蛋白44抗體規(guī)格: 0.2ml

RNF6  環(huán)指蛋白6抗體規(guī)格: 0.2ml

RNF8  環(huán)指蛋白8抗體規(guī)格: 0.2ml

TRIM3/RNF22  環(huán)指蛋白22抗體規(guī)格: 0.2ml

RNF10  環(huán)指蛋白10抗體規(guī)格: 0.2ml

RNF11  環(huán)指蛋白11抗體規(guī)格: 0.2ml

RNF12  環(huán)指蛋白12抗體規(guī)格: 0.2ml

MTM1/Myotubularin  肌微管1抗體規(guī)格: 0.2ml
實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。