據今年3月份發(fā)布在ResearchSquare的一項研究，佛羅里達的科學家使用CUT&RUN技術，建立了眼球晶狀體中HIF1α結合位點的全基因組圖。
我們知道，基因表達可以通過許多不同的機制進行調節(jié)，包括轉錄因子、組蛋白和其他DNA結合蛋白。繪制出DNA和蛋白質之間的相互作用圖譜，對于理解基因激活或抑制以及其他細胞過程至關重要。
傳統(tǒng)上，可以通過進行染色質免疫沉淀和測序(ChIP-seq)來分析這些相互作用。但是這種方法需要大量的起始材料才能產生足夠強的信號以消除背景噪聲，并且經常返回假陽性信號。同時，ChIP-seq還需要優(yōu)化的超聲處理來破碎染色質，這可能非常耗時并可能導致樣品損失。
在zui近的一項研究中，佛羅里達大西洋大學和國家糖尿病、消化和腎臟疾病研究所的科學家們利用CUT&RUN技術建立了一個功能性全基因組圖譜，該圖譜是一種稱為缺氧誘導因子的蛋白質復合物的特異性結合位點—HIF1α，位于人眼的晶狀體中。該團隊表示選擇CUT&RUN而不是ChIP-seq分析，是因為前者不需要DNA-蛋白質交聯。此外，與ChIP-seq相比，前者成功實驗所需的細胞計數J低。
正常而言，隨著出生后眼睛的發(fā)育，提供健康血液供應的血管隨著時間的推移開始萎丨縮。結果，眼睛中的氧氣含量穩(wěn)步下降，造成缺氧環(huán)境。HIF1α作為一種蛋白質復合物，可調節(jié)身體對缺氧環(huán)境的反應，這意味著它可以在晶狀體細胞發(fā)育和體內平衡中發(fā)揮作用。
研究人員首先選擇培養(yǎng)10天左右的大的WhiteLeghorn雞胚胎中分離出晶狀體細胞。收獲的細胞用稱為DMOG的HIF1α激活劑處理4小時，并用ConA包被的磁珠固定細胞核。之后，樣品被分為兩組：一組用HIF1α抗體處理，另一組用IgG抗體處理。將pA/MNase添加到樣品中以啟動碎裂。這種融合蛋白在與感興趣的蛋白質相互作用的特定區(qū)域剪切DNA——在這種情況下，該蛋白質是HIF1α。通過向樣品中加入CaCL2溶液來激活MNase，將DNA片段釋放到上清液中。CUT&RUN片段用蛋白酶K處理1小時，然后分離DNA進行測序。
在HIF1α激活后，CUT&RUN在原代晶狀體細胞中鑒定了8000多種HIF1α-DNA特異性復合物。他們能夠使用ATAC-seq和RNA-seq驗證并完成結合位點的映射，這表明這些復合物中約有1200個緊密聚集在染色質可及區(qū)域。進一步的分析揭示了526個基因的激活或抑制，其中116個基因在轉錄起始位點10kB內顯示HIF1α結合位點。
該實驗中收集的數據有助于建立眼晶狀體中HIF1αDNA復合物的個功能圖，同時也強調了健康晶狀體發(fā)育對HIF1α的需求。zui終，CUT&RUN技術的這種成功應用，有助于接下來的大量研究，重點是了解某些蛋白質可能對基因表達的作用。
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結果展示：
