CUT&RUN全稱Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease，是一種新型技術(shù)方法。有關(guān)CUT&RUN的常見的3個(gè)問題整理如下：
1、如何驗(yàn)證一抗在CUT&RUN中起作用？
對(duì)于CUT＆RUN實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證數(shù)據(jù)可以包括例如 Tapestation或Bionalyzer圖顯示大小分布，qPCR數(shù)據(jù)顯示靶標(biāo)富集。由于CUT&RUN的樣本量較低，獲得的DNA也相對(duì)較少，對(duì)于低豐度的靶蛋白，濃度通常太低而無法使用熒光測(cè)定法或毛細(xì)管電泳測(cè)量，所以需要選擇高靈敏度的Qubit 或 Nanodrop fluorometer以及Tapestation或Bionalyzer。如果獲得的DNA＜50bp ，PCR擴(kuò)增是無法進(jìn)行的。一旦產(chǎn)生了測(cè)序文庫并進(jìn)行了測(cè)序圖測(cè)序，就可以讀取并驗(yàn)證讀取在已知結(jié)合位點(diǎn)的積累。
2、實(shí)驗(yàn)中是否需要使用二抗？
二抗的使用取決于抗體和pA/G-MNase融合蛋白的宿主和亞型，對(duì)于pA / G-MNase結(jié)合，可能是需要的。蛋白A對(duì)所有兔IgG抗體具有良好的高親和力，但對(duì)大鼠，山羊和綿羊IgG同種型抗體以及某些小鼠IgG抗體亞類（尤其是IgG1）具有低親和力。另一方面，蛋白G與小鼠，山羊，綿羊和大多數(shù)大鼠IgG的Fc區(qū)結(jié)合良好。但是，它對(duì)兔IgG的親和力低于蛋白A。當(dāng)使用我們改進(jìn)后的CUT＆RUN 方案時(shí)通常不需要二抗。原始的方案則需要二抗來確保融合蛋白與抗體的有效結(jié)合。
3、CUN&RUN是否可改造適用于RIP-seq?
改善CUT&RUN的操作步驟作用在RNA上，以作為RIP-seq的替代方案是有可能可以實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞質(zhì)中的RNA如果缺乏5‘cap和3‘poly-A則易被降解，因此建議選用細(xì)胞核作為樣本。由于核被膜不含*，所以不需要使用dignitonin。分離出來的細(xì)胞核可通過核被膜上的糖蛋白固定在ConA磁珠上，再加入抗體識(shí)別目的蛋白，然后加入pA/G-MNase靶向到抗體上，從而切割RNA。zui后將RNA分離出來轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行測(cè)序和定位。
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