革蘭氏染色的基本原理及操作方法！
革蘭氏染色的基本原理及操作方法！
革蘭染色法是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立，直到現(xiàn)今，革蘭氏染色法仍是細菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。
細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，而后經(jīng)碘液進行媒染，之后用酒精脫色，在一定條件下有的細菌媒染后的顏色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌(G+),后者為革蘭氏陰性菌(G-)。為方便進一步觀察，脫色后可再用一種紅色染料如堿性番紅等進行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被重新染上紅色。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌、螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽孢桿菌都呈現(xiàn)負反應(yīng)。
革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣。現(xiàn)在一般認為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。
另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同pH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的染色液pH和染色時間等條件要嚴(yán)格控制。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)； pH很低時，則都可呈負反應(yīng)。此外，兩類菌的細胞壁等對結(jié)晶紫-碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間、脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。
革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，具體操作方法是：
(一)涂片固定
在干凈的載玻片*滴加一滴蒸餾水，用接種環(huán)進行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成菌懸液并涂布成直徑約1cm的薄層。為避免因菌數(shù)過多聚集成團，不利于觀察細菌個體形態(tài)，可在載玻片一側(cè)進行上述操作，而在另一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進行稀釋，涂布成薄層。若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可，如菌液濃度較大，也可使用水滴再進行一次稀釋。
涂片在室溫條件下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈火焰上方較高的位置微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。
標(biāo)本干燥后即進行固定，固定的目的有三個：
(1)殺死微生物，固定細胞結(jié)構(gòu)。
(2)保證菌體能更牢固的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本水洗時被水沖洗掉。
(3)改變?nèi)玖蠈毎耐ㄍ感?，因為死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。
固定常常利用高溫，手執(zhí)載玻片的一端(涂有標(biāo)本的遠端),標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次，共約2s-3s,并不時以載玻片背面加熱，載玻片背面觸皮膚，以不覺過燙為宜(不超過60℃),待放置冷后，再進行染色。
（二)染色
在固定過的涂片菌膜上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染色液應(yīng)*覆蓋整個菌膜，染色1min。
(三)水洗
染色到一定的時間，拿住玻片使之成450角，用細小的水流把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。
(四)媒染
加碘液覆蓋涂面染1 min。在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性的化合物，可增加染料和細菌的親和力。
(五)水洗，用吸水紙吸去水分
用細小的水流緩慢沖洗涂片上的染色液，用吸水紙吸干。
(六)脫色
加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色， 20 s~30 s后再進行水洗，吸去水分。
(七)復(fù)染
蕃紅染色液染色10 s后， 自來水沖洗。
(八)干燥，鏡檢
染色的結(jié)果，革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色，負反應(yīng)菌體都呈紅色。
(1)水流沖洗時，將載玻片微微傾斜，讓水流從涂菌處的上方而不要直接在涂菌處沖洗，同時應(yīng)調(diào)小水流避免染色液飛濺。染色液如果滴在水池或桌面上，可以用84消毒液擦拭去掉顏色，但要注意84消毒液不可直接用于皮膚和衣物等。
(2)在實驗中經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果，假陽性主要是由于脫色不*，可能是由于涂片過厚或者是結(jié)晶紫染色過度等，導(dǎo)致脫色不*。假陰性可能是因為細胞固定過度，造成細胞壁通透性的改變，而出現(xiàn)假陰性結(jié)果；另外，細胞培養(yǎng)時間過長，可能已經(jīng)有部分細胞發(fā)生死亡或自溶，也導(dǎo)致細胞壁通透性的改變而出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。避免假陽性或假陰性的辦法是在同一張載玻片上設(shè)置革蘭氏陽性菌(如*) 和革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)的對照與待染色的菌一起進行染色， 當(dāng)對照菌呈現(xiàn)預(yù)期的染色結(jié)果時表明染色過程正常。
(3)所觀察的細胞一般應(yīng)用18 h~24 h的活力培養(yǎng)物。因為一此菌株隨菌齡的變化在革氏染色反應(yīng)和形態(tài)學(xué)上也會發(fā)生變化。
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