蛋白質(zhì)和吊白塊的檢測方法與操作步驟！

蛋白質(zhì)和吊白塊的檢測方法與操作步驟！

一、蛋白質(zhì)的檢測

1 凱氏定氮法

2 規(guī)范性引用性文件

本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其版本(包括所有的修)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3 原理

食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。

4 試劑和材料

除非另有規(guī)定，本方法中所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的三級水。

4.1 硫酸銅(CuSO4·5H2O)

4.2 硫酸鉀(K2SO4)

4.3 硫酸(H2SO4 密度為 1.84g/L)

4.4 硼酸(H3BO3)

4.5 甲基紅指示劑(C15H15N3O2)

4.6 溴甲酚綠指示劑(C21H14Br4O5S)

4.7 亞甲基藍(lán)指示劑(C16H18ClN3S·3H2O)

4.8 氫氧化鈉(NaOH)

4.9 95%乙醇(C2H5OH)

4.10 硼酸溶液(20 g/L)：稱取 20 g 硼酸，加水溶解后并稀釋至 1000 mL。

4.11 氫氧化鈉溶液(400 g/L)：稱取 40 g 氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至 100 mL。

4.12 硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(0.0500 mol/L)或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(0.0500 mol/L)。

4.13 甲基紅乙醇溶液(1 g/L)：稱取 0.1g 甲基紅，溶于 95%乙醇，用 95%乙醇稀釋至 100 mL。

4.14 亞甲基藍(lán)乙醇溶液(1 g/L)：稱取 0.1g 亞甲基藍(lán)，溶于 95%乙醇，用 95%乙醇稀釋至 100 mL。

4.15 溴甲酚綠乙醇溶液(1 g/L)：稱取 0.1g 溴甲酚綠，溶于 95%乙醇，用 95%乙醇稀釋至 100 mL。

4.16 混合指示液：2 份甲基紅乙醇溶液(4.13)與1 份亞甲基藍(lán)乙醇溶液(4.14)臨用時混合。也可用1 份甲基紅乙醇溶液(4.13)與 5 份溴甲酚綠乙醇溶液(4.15)臨用時混合。

5 儀器和設(shè)備

5.1 天平：感量為 1mg

5.2 定氮蒸餾裝置：如圖 1所示

5.3 自動凱氏定氮儀

6 分析步驟

6.1 凱氏定氮法

6.1.1 試樣處理：稱取充分混勻的固體試樣 0.2 g～2 g、半固體試樣 2 g～5 g或液體試樣 10 g～25 g(約相當(dāng)于 30 mg～40 mg 氮) ，至 0.001 g，移入干燥的 100 mL、250 mL 或 500 mL 定氮瓶中，加入 0.2 g 硫酸銅(4.1) 、6 g 硫酸鉀(4.2)及 20 mL 硫酸(4.3) ，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶以 45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫*停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色并澄清透明后，再繼續(xù)加熱 0.5 h～1 h。取下放冷，小心加入 20 mL 水。放冷后，移入 100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗(yàn)。

6.1.2 測定：按圖 1 裝好定氮蒸餾裝置，向水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至 2/3 處，加入數(shù)粒玻璃珠，加甲基紅乙醇溶液(4.13)數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸(4.3) ，以保持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生器內(nèi)的水并保持沸騰。

6.1.3 向接收瓶內(nèi)加入 10.0 mL 硼酸溶液(4.10)及 1 滴～2 滴混合指示液(4.16) ，并使冷凝管的下端插入液面下， 根據(jù)試樣中氮含量， 準(zhǔn)確吸取 2.0 mL～10.0 mL 試樣處理液由小玻杯注入反應(yīng)室， 以 10 mL水洗滌小玻杯并使之流入反應(yīng)室內(nèi)，隨后塞緊棒狀玻塞。將 10.0 mL 氫氧化鈉溶液(4.11)倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。蒸餾 10 min后移動蒸餾液接收瓶，液面離開冷凝管下端，再蒸餾 1 min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部， 取下蒸餾液接收瓶。 以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(4.12)滴定至終點(diǎn)， 其中 2 份甲基紅乙醇溶液(4.13)

與 1 份亞甲基藍(lán)乙醇溶液(4.14)指示劑，顏色由紫紅色變成灰色，pH 5.4;1 份甲基紅乙醇溶液(4.13)與 5 份溴甲酚綠乙醇溶液(4.15)指示劑，顏色由酒紅色變成綠色，pH 5.1。同時作試劑空白。

1-電爐;2-水蒸氣發(fā)生器(2 L 燒瓶) ;3-螺旋夾;4-小玻杯及棒狀玻塞;5-反應(yīng)室;6-反應(yīng)室外層;7-橡皮管及螺旋夾;8-冷凝管;9-蒸餾液接收瓶。

6.2 自動凱氏定氮儀法

稱取固體試樣0.2 g～2 g、 半固體試樣2 g～5 g或液體試樣10 g～25 g (約相當(dāng)于30 mg～40 mg氮) ，至 0.001 g。按照儀器說明書的要求進(jìn)行檢測。

7 分析結(jié)果的表述

試樣中蛋白質(zhì)的含量按式(1)進(jìn)行計算。

式中：

X——試樣中蛋白質(zhì)的含量，單位為克每百克(g/100 g) ;

V1——試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為毫升(mL) ;

V2——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為毫升(mL) ;

V3——吸取消化液的體積，單位為毫升(mL) ;

c——硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，單位為摩爾每升(mol/L) ;

0.0140——1.0 mL 硫酸[c (1/2H2SO4)=1.000 mol/L]或鹽酸[c (HCl) =1.000 mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克(g) ;

m——試樣的質(zhì)量，單位為克(g) ;

F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。一般食物為 6.25;純?nèi)榕c純?nèi)橹破窞?6.38;面粉為 5.70;玉米、高梁為 6.24;花生為 5.46;大米為 5.95;大豆及其粗加工制品為 5.71;大豆蛋白制品為 6.25;肉與肉制品為 6.25;大麥、小米、燕麥、裸麥為 5.83;芝麻、向日葵為 5.30;復(fù)合配方食品為 6.25。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，蛋白質(zhì)含量≥1 g/100 g 時，結(jié)果保留三位有效數(shù)字;蛋白質(zhì)含量<1 g/100 g 時，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

8 精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的差值不得超過算術(shù)平均值的 10 %。

二、吊白塊檢測

目前，食品中吊白塊含量的測定只是通過對食品中甲醛含量的測定來判定的，由于天然食品中也有可能存在極少量的甲醛，若測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)食品中甲醛呈陽性，并不能就此說明食品中含有吊白塊成分，若食品中甲醛含量較高且二氧化硫含量也相應(yīng)較高時，則基本上可以判定該食品中含有吊白塊成分。通過對試劑、吸收波長、線性、回收率、重現(xiàn)性等相關(guān)試驗(yàn)，制定了一個比較切實(shí)可行的食品中吊白塊含量的檢測方法，具體介紹如下：

1、原理

在酸性條件下，對樣品進(jìn)行蒸餾，餾出物用水吸收，吸收液中的甲醛與乙酰丙酮及銨離子反應(yīng)，生成黃色物質(zhì)，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。在另一酸性條件下，對樣品重新進(jìn)行蒸餾，餾出物用2%乙酸鉛水溶液吸收，吸收液酸化后，用標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定測定二氧化硫含量。

2、主要儀器與試劑

2.1、分光光度計

2.2、磷酸(AR級)

2.3、乙酰丙酮溶液：在100ml蒸餾水中加入醋酸銨25 g，冰醋酸3 mL和乙酰丙酮0.4 mL，振搖促溶，儲備于棕色瓶中，此液可保存1個月。

2.4、甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲備液：吸取10 mL甲醛(38%～40%)，移入500 mL容量瓶中，加入0.5 mL硫酸(1+35)，加水稀釋至刻度，混勻。吸取5 mL，置于250 mL量瓶中，加0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液50 mL，1mol/L KOH溶液20 mL，在室溫放置15 min后，加10%硫酸15 mL酸化，再放置15 min后，加入50 mL蒸餾水，用0.1 mol/L*標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至草黃色，加入新配制的0.5%淀粉指示劑1 mL，繼續(xù)滴定至蘭色消失為終點(diǎn)，同時做空白試驗(yàn)。甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度計算：

X=(V1-V2)×C×15/5

2.5、甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液

將標(biāo)定后的甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲備液用水稀釋至5 μg/mL。

3、操作步驟

3.1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別吸取0，0.50，1.00，3.00，5.00，7.00 mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液(相當(dāng)于0，2.5，5.0，15.0，25.0，35.0 μg甲醛)于25 mL比色管中，補(bǔ)充蒸餾水至10 mL，加入1 mL乙酰丙酮溶液(2.3)，混勻，置沸水浴中3 min，取出冷卻，于415 nm波長處，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，用1 cm比色皿進(jìn)行比色，根據(jù)測得的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2、樣品處理

稱取經(jīng)粉碎的樣品5～10 g，置于500ml蒸餾瓶中，加入蒸餾水200 mL，磷酸(2.2)15 mL，立即進(jìn)行加熱蒸餾，冷凝管下口應(yīng)事先插入盛有10mL蒸餾水且置于冰浴的容器中。收集蒸餾液約180 mL，定容至200 mL，另作空白蒸餾。

3.3、顯色操作

視所檢試樣中吊白塊含量高低，吸取2～10mL蒸餾液(3.2)，補(bǔ)充蒸餾水至10 mL，加入1 mL乙酰丙酮溶液(2.3)，混勻，置沸水浴中3 min，取出冷卻，于415 nm波長處，以蒸餾水調(diào)節(jié)零點(diǎn)，用1 cm比色皿進(jìn)行比色，根據(jù)測得的吸光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算結(jié)果。

4、計算

X1= (V2×W1×5.133)/(W2×V2×V3 )

式中：X1;試樣中吊白塊的含量，mg/kg;

V1：樣品管相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)管體積，ml;

W1：每ml甲醛標(biāo)準(zhǔn)液含甲醛量，μg;

W2：試樣重，g‘

V2：顯色操作所取蒸餾液體積，ml;

V3：蒸餾液總體積，ml;

5.133：甲醛換算為吊白塊系數(shù)。

注：若將磷酸改為1+1的鹽酸，蒸餾液用2%乙酸鉛溶液吸收，通過對該吸收液二氧化硫的測定，可作為在甲醛存在下確定是否有吊白塊的依據(jù)。

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