大腸菌群平板計(jì)數(shù)法常見問題！
大腸菌群平板計(jì)數(shù)法常見問題！
1、VRBA培養(yǎng)相關(guān)問題
（1）所用器皿是否需要滅菌？
答：不需要。配制培養(yǎng)基所用到的錐形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要滅菌，但要求一定要清洗干凈，表面無污漬、無殘留。煮沸完成后，取下錐形瓶，用一般常用的衛(wèi)生紙（軟紙）覆蓋瓶口，用橡皮筋纏繞，待冷卻至適宜溫度即可傾注培養(yǎng)基。在傾注培養(yǎng)基時(shí)，須點(diǎn)燃酒精燈，稍微灼燒錐形瓶口。
如何保持“煮沸2min”？
答：可以用電磁爐或電熱板進(jìn)行加熱煮沸，在該培養(yǎng)基即將煮沸時(shí)調(diào)低溫度。實(shí)際操作時(shí)，不需要嚴(yán)格按照此要求進(jìn)行，加熱煮沸數(shù)秒即可。原因：本培養(yǎng)基很難保持煮沸2min，一旦煮沸，則培養(yǎng)基很快上涌、翻騰，若不調(diào)低溫度或立刻采取其他措施，則培養(yǎng)基可在數(shù)秒內(nèi)噴涌出來，嚴(yán)重者可噴涌2米以上、電磁爐周圍1—2米范圍內(nèi)都是培養(yǎng)基飛濺的范圍（實(shí)驗(yàn)室危險(xiǎn)因子之一）。
1、若培養(yǎng)基未用完，是否可以冷藏起來下次用？
答：不可以。4789.28中已規(guī)定，固體培養(yǎng)基多允許熔融1次（指的是經(jīng)過高壓滅菌冷卻后的培養(yǎng)基還可以熔融一次后使用）。且VRBA培養(yǎng)基冷卻后，再次熔融時(shí)非常容易噴涌，若溫度控制不當(dāng)，底部培養(yǎng)基熔融后很快就會發(fā)生噴涌（即培養(yǎng)基未*熔融就會發(fā)生噴涌現(xiàn)象）。
（4）傾注完成后是否需要“覆蓋一層”？如何覆蓋？
答：一般情況下不需要覆蓋。在實(shí)際操作過程中，若檢驗(yàn)員初次接觸該食品（或食品品類），則有必要在傾注培養(yǎng)基后再覆蓋一層（原因是不清楚該樣品是否會發(fā)生蔓延）。而如此往復(fù)測試幾次后，若該樣品或食品品類均不存在蔓延現(xiàn)象，則以后的實(shí)驗(yàn)中都不需要進(jìn)行覆蓋。若重復(fù)多次測試后都有蔓延現(xiàn)象，則以后的檢驗(yàn)中都進(jìn)行覆蓋，是在原培養(yǎng)基已凝固或半凝固（不會發(fā)生晃動）時(shí)再傾注一層培養(yǎng)基（“一層”是指緩慢傾注培養(yǎng)基至培養(yǎng)基剛好能夠覆蓋整個(gè)平皿）。
2、如何確定培養(yǎng)基上長的是不是大腸菌群？
答：建議新手們認(rèn)真按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，此證實(shí)試驗(yàn)簡單易操作，每一次VRBA上有菌落生長都進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，如此往復(fù)3-4次，對于哪種形態(tài)才是大腸菌群已經(jīng)能夠了然于心。
3、兩個(gè)梯度都長了菌，如何選??？
答：選取15-150CFU之間的平板（指的是VRBA平板上所有菌落數(shù)在此范圍），挑取可疑菌落進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)。詳細(xì)舉例說明：若有兩個(gè)連續(xù)梯度的4個(gè)平板上菌落數(shù)均在15-150之間，則4個(gè)平板上的菌落都要挑取進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，實(shí)際操作時(shí)，可靈活操作，如：1:10的兩個(gè)平板上的菌落數(shù)分別為120、123，1:100的兩個(gè)平板的菌落數(shù)分別為16、18，嚴(yán)格來講必須至少在每個(gè)平板上分別挑取5個(gè)可疑菌落、5個(gè)典型菌落進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，如此需要40根GBLB肉湯管。建議使用鎳合金接種環(huán)（即傳統(tǒng)的接種環(huán)，而不是一次性塑料接種環(huán)），因?yàn)閂RBA上生長的菌落（無論典型或可疑）大部分長在底層、且菌落一般較大，被培養(yǎng)基覆蓋，傳統(tǒng)的接種環(huán)較細(xì)，用以刮去上層培養(yǎng)基較方便，挑取菌落也較方便。
4、如何進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)？菌取數(shù)量？
答：同上所述，建議新手們VRBA上的所有不同形態(tài)的菌落都進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)。每種不同形態(tài)都挑取5-10個(gè)進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)（若BGLB管足夠，建議多挑取幾個(gè)進(jìn)行試驗(yàn)）。
注意：A.每種可疑菌落挑取5個(gè)，每個(gè)菌落放入1管GBLB管中；B.“產(chǎn)氣者，記為大腸菌群陽性管”，就要求在實(shí)驗(yàn)前須認(rèn)真篩選BGLB管，凡產(chǎn)氣的GBLB管應(yīng)棄去不用。
5、結(jié)果如何計(jì)算？
答：首先，在VRBA培養(yǎng)24h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)可疑大腸菌群和典型大腸菌群（何為可疑、何為典型？同“2”，檢驗(yàn)員多進(jìn)行幾次實(shí)驗(yàn)后自然很清楚典型的大腸菌群是何種形態(tài)）的數(shù)量。假如在1:10的平板上可疑大腸菌群有10個(gè)，典型大腸菌群有6個(gè)；其次，進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，挑取上述可疑和典型大腸菌群各5個(gè)（或者全部挑?。?，假如10個(gè)可疑大腸菌群中有3個(gè)證實(shí)為陽性，6個(gè)典型大腸菌群中有5個(gè)證實(shí)為陽性，則計(jì)算方法如下：終大腸菌群數(shù)=經(jīng)證實(shí)的大腸菌群數(shù)=可疑大腸菌群經(jīng)證實(shí)的數(shù)量+典型大腸菌群經(jīng)證實(shí)的數(shù)量=10×（6/10）×10+6×（5/6）×10=110。
6、若平板上很多菌落，終證實(shí)全部為陰性，結(jié)果如何計(jì)算？
答：根據(jù)第3條,選取適宜菌落數(shù)的平板挑取菌落進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，若證實(shí)全部為陰性，則需要再挑取更低稀釋度的平板上的菌落（建議可疑和典型菌落分別挑取10個(gè)）進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，若第二次證實(shí)試驗(yàn)均呈陰性，以＜1乘以低稀釋度進(jìn)行計(jì)算，如：1:10的平板菌落數(shù)分別為120、123，1:100的平板上菌落數(shù)分別為16、18，首先挑取1:100的兩個(gè)平板上的菌落進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，若全部為陰性，再挑取1:10的兩個(gè)平板上的菌落進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，若1:10的平板上的菌落數(shù)證實(shí)為陰性，則終計(jì)算過程為＜1x10，終結(jié)果為＜10；若1:10的的平板上的菌落有陽性管，則按照第5條進(jìn)行計(jì)算。
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