土壤微生物研究取樣的準(zhǔn)備工作與操作方法！
土壤微生物研究取樣的準(zhǔn)備工作與操作方法！
一、準(zhǔn)備工作
⒈制定采樣計(jì)劃
采樣前需要確定好實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、采樣樣地、樣品?shù)量、采樣方法、采樣工具、交通、線路以及天氣等情況。通常需要準(zhǔn)備一份采樣報(bào)告，詳細(xì)記錄采樣的具體情況，例如采樣日期、時(shí)間，采樣點(diǎn)詳細(xì)位置（GPS定位），天氣狀況（氣溫、降水、濕度、云等）等信息。
⒉樣地資料收集
確定采樣點(diǎn)后，可以提前收集、了解該地的土壤類(lèi)型、天氣資料、水文資料等信息。實(shí)際采樣前根據(jù)所收集的資料進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)勘查，終確定確切的采樣點(diǎn)。
⒊采樣器具
⑴采樣器具
A. 工具類(lèi)：土鉆、鐵鏟、篩子、鑷子、藥匙、刷子以及適合特殊采樣要求的工具等。
B. 器材類(lèi)：50 mL 無(wú)菌管、50 mL 無(wú)菌瓶、美國(guó)parafilm封口膜、卷尺、GPS、坡度儀、土壤比色卡、樣品箱（具冷藏功能或含干冰）、冰袋、樣品袋、一次性手套、75%酒精、滅菌棉球、無(wú)菌水、液氮、干冰等。
C. 文具類(lèi)：樣品標(biāo)簽、記號(hào)筆、采樣記錄表等。
D. 安全防護(hù)用品類(lèi)：工作服、工作鞋、雨具、安全帽、藥品箱等。
⑵注意事項(xiàng)
A.采樣工具和盛放土壤樣品的容器必須提前滅菌（錫箔紙包裹，高壓蒸汽滅菌后，120℃烘箱過(guò)夜），避免外源物質(zhì)干擾；
B.避免使用吸水、會(huì)釋放溶劑或增塑劑等物質(zhì)的器具來(lái)盛放土壤樣品。
二、土壤取樣方案
⒈位置選擇
根據(jù)研究目的，進(jìn)行采樣點(diǎn)的選擇，采樣點(diǎn)的選擇應(yīng)遵循以下原則：
A.采樣點(diǎn)土壤類(lèi)型特征明確，地形相對(duì)平坦、穩(wěn)定，植被良好；
B.坡腳、洼地等具有從屬景觀特征的地點(diǎn)不宜設(shè)置采樣點(diǎn)；
C.城鎮(zhèn)、住宅、圍墻、道路、溝渠、田埂、糞坑、堆肥點(diǎn)、墳?zāi)沟鹊厝藶楦蓴_大，可能造成土壤特性錯(cuò)亂，使土壤失去代表性，不宜設(shè)置采樣點(diǎn)；
D.采樣點(diǎn)離鐵路、公路至少300 m以上；
E.采樣點(diǎn)以剖面發(fā)育完整、層次較清楚、無(wú)侵入體為準(zhǔn)，不宜在水土流失嚴(yán)重或者表層土被破壞處設(shè)置采樣點(diǎn)。
F.不宜在多種土類(lèi)、多種母質(zhì)交錯(cuò)分布、面積較小的邊緣地區(qū)布設(shè)采樣點(diǎn)。
注意事項(xiàng)：確定采樣點(diǎn)后可以使用精準(zhǔn)地圖或者GPS進(jìn)行采樣點(diǎn)定位，或者在采樣點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，便于以后重復(fù)取樣或者進(jìn)行比較試驗(yàn)。
⒉取樣樣方設(shè)置
土壤橫向取樣方法示意圖：
⒊土壤取樣操作方法
⑴普通土壤（Bulk Soil）樣本取樣方法
A. 移除土壤表面覆蓋物，包括植物、苔蘚、可見(jiàn)根系、凋落物以及可見(jiàn)的土壤動(dòng)物等；
B. 對(duì)采樣器使用酒精棉球擦拭，待酒精揮發(fā)*后，可使用采樣樣方處土壤浸潤(rùn)采樣器。后續(xù)每次更換樣方均需重復(fù)此步驟；
C. 同一樣方采取多點(diǎn)取樣（建議4-5個(gè)取樣點(diǎn)等量均勻混合為一個(gè)樣本），去除樣品中的植物、可見(jiàn)動(dòng)物以及石粒等，然后根據(jù)土壤情況，選擇是否過(guò)篩：①*過(guò)2 mm篩；②一些有機(jī)質(zhì)（如粗腐殖質(zhì)或泥炭等）不能通過(guò)2mm篩，此時(shí)可以選擇過(guò)4-5 mm篩；③如果土壤粘度太大或者含水量太高，可以選擇不過(guò)篩。
D. 將混合好的土壤樣本，分裝多份（3-5份備份樣本），每份3-5 g，標(biāo)記好樣本信息后液氮速凍（如果條件不允許，可置于裝有冰/干冰的泡沫盒中，黑暗環(huán)境下，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室），隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于測(cè)定土壤微生物；另外留出一部分土壤，用于測(cè)定土壤理化指標(biāo)（如有機(jī)質(zhì)、全氮、礦質(zhì)元素等）。
⑵根際土壤（Rhizosphere soil）樣本取樣方法
①作物類(lèi)（含草地等矮小植物）根際土壤取樣方法：
A. 采集植物植株（多點(diǎn)取樣法），去除根部大塊土壤，置于裝有冰/干冰的泡沫盒中，黑暗環(huán)境下，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；
B. 無(wú)菌工作臺(tái)中，晃動(dòng)植物根部，去除根部松散的土壤后，使用無(wú)菌刷子從根部收集殘留土壤，或?qū)χ参锔渴褂脽o(wú)菌水（或PBS緩沖液）振蕩（詳細(xì)參數(shù)參考引用文獻(xiàn)）洗滌植物根系，洗滌液進(jìn)行12000 g離心10 min以上收集沉淀（或過(guò)0.22 μm濾膜，收集濾膜）；
C. 同一樣方多點(diǎn)取樣的根際土壤樣本等量混合均勻，標(biāo)記好樣本信息后液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。
②林木類(lèi)根際土壤取樣方法：
A. 使用土轉(zhuǎn)采集地面下10-20 cm根際土壤，置于裝有冰/干冰的泡沫盒中，黑暗環(huán)境下，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；
B. 視情況，選擇2-5 mm孔徑無(wú)菌篩網(wǎng)過(guò)篩；
C. 同一樣方多點(diǎn)取樣獲得的土壤樣本等量混合均勻，標(biāo)記好樣本信息后液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。
（Nature, 2013）
⒋樣品存儲(chǔ)條件
A. 避免樣品反復(fù)凍融，以保證恒定低溫效果；
B.注意樣品在實(shí)驗(yàn)室保存和分析過(guò)程中的密封性，以免凝結(jié)的水汽或者其他污染源對(duì)樣品造成污染。
三、樣本寄送
A. DNA：總量 > 500 ng，濃度 > 20 ng/µl，無(wú)明顯降解，土壤：2 g；
B. 單次送樣樣本量需 ≥ 20個(gè)，送樣管（凍存管）務(wù)必標(biāo)清樣品編號(hào)，管口使用Parafilm封口膜密封（防止樣本間交叉污染），并將填寫(xiě)完整的送樣訂單用自封袋密封后，隨同樣品一起使用干冰運(yùn)輸寄送至公司。
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