試劑顯色時 A、B 液按順序加入且間隔不超過 10min，如先將兩液混合再加樣則需保證等體積混合。顯色劑不宜過多，注意避光反應(yīng)。顯色是最后一步溫育反應(yīng)，酶將無色底物催化反應(yīng)呈有色，反應(yīng)的溫度和時間均為影響結(jié)果的重要因素，目前市場上大多數(shù)進(jìn)口的 ELISA 檢測顯色溫度處于 18~30℃。一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，但陽性孔會隨時間的延長而顯色加強(qiáng)。研究表明，顯色溫度對實驗結(jié)果有明顯影響，顯色溫度不同，試劑最di檢測能力差距非常大，溫度低于 21℃時試劑盒對于質(zhì)控物的檢出能力下降，溫度過低導(dǎo)致結(jié)合反應(yīng)速率變慢，顯色不充分，造成低值陽性結(jié)果的漏檢，所以操作中應(yīng)嚴(yán)格控制溫度。顯色時間不宜過短，因為一些低滴度可能不能及時出現(xiàn)反應(yīng)，造成假陰性結(jié)果。結(jié)果判斷應(yīng)按照說明書在規(guī)定時間內(nèi)完成，研究報道終止反應(yīng)后的時間對 OD 值結(jié)果有明顯影響，10~15min陽性結(jié)果 OD 值逐漸下降，陰性結(jié)果的 OD 值有所上升，所以必須嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行，薛春楊等認(rèn)為結(jié)果判斷需在加入終止液后 10min 內(nèi)完成，避免出現(xiàn)孔內(nèi)結(jié)晶影響酶標(biāo)儀的測試，避免強(qiáng)光下進(jìn)行。

在加液和混合過程中產(chǎn)生氣泡、微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面都可能引起吸光值的升高，易造成假陽性結(jié)果，若顯色但酶標(biāo)儀讀值為陰性的灰色值樣區(qū)的樣本不管其是否來源于高危人群均需復(fù)檢并參考參比試劑。