Caspase3/7活細胞熒光實時法檢測試劑盒-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9580

英文名稱：

產(chǎn)品規(guī)格：100T|50T

貨號：FS-X9580

產(chǎn)品介紹:

凋亡早期的重要特征之一是半胱氨suan特異性蛋白酶——caspase家族蛋白的活性激活。這一類酶可以參與到一系列的生化反應中，響應凋亡早期信號并導致相應的蛋白底物剪切，繼而引發(fā)細胞解體。目的底物可識別的序列包含天門冬氨suan殘基，剪切發(fā)生在序列的羰基段。

Caspase3/7活細胞熒光實時法檢測試劑盒采用新型的熒光底物為原料，可以檢測凋亡細胞中激活的caspase3/7.這種具有膜親和型的檢測試劑盒由一個4氨基的小肽（DEVD）和一種核酸結合染料。凋亡發(fā)生時，caspase3/7蛋白被激活，從而剪切caspase3/7識別序列DEVD肽段。剪切底物后，游離的核酸染料與DNA結合，從而發(fā)出亮綠色熒光信號。

操作步驟

1.1 以合適的培養(yǎng)基懸浮細胞或貼壁細胞，加入合適的化合物或藥物，刺激細胞誘導凋亡。

1.2 去除藥物或化合物，以新鮮培養(yǎng)基洗滌細胞2-3次，更換新鮮培養(yǎng)基后，以1μL/mL的量加入caspase3/7檢測液，使得caspase3/7檢測試劑工作液濃度為1μM。（注意： Caspase3/7 檢測試劑工作液濃度為0.5μM~2μM，您根據(jù)細胞量以及培養(yǎng)液的體積進行調整優(yōu)化。）

1.3 37℃，避光孵育30min，或室溫孵育45-60min。

1.4 熒光顯微鏡觀察拍照或熒光光度計讀數(shù)。

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

一氧化氮合mei運輸因子(NOSTRIN)elisa檢測試劑盒英文名稱：NOSTRIN ELISA Kit，NOSTRIN，

煙型受體α3(CHRNα3)elisa檢測試劑盒英文名稱：CHRNα3 ELISA Kit，CHRNα3，

血小板反應蛋白2(THBS2)elisa檢測試劑盒英文名稱：THBS2 ELISA Kit，THBS2，

阿mi巴(Amebiasis)elisa檢測試劑盒英文名稱：Amebiasis ELISA Kit，Amebiasis，

α輔肌動蛋白4(ACTN-4)elisa檢測試劑盒英文名稱：ACTN-4 ELISA Kit，ACTN-4，

β干擾su(IFN-β/IFNB)elisa檢測試劑盒英文名稱：IFN-β/IFNB ELISA Kit，IFN-β/IFNB，

Toll樣受體4(TLR4)elisa檢測試劑盒英文名稱：TLR4 ELISA Kit，TLR4，

P物質受體(SP-R)elisa檢測試劑盒英文名稱：SP-R ELISA Kit，SP-R，

H-鈣粘著蛋白/H-鈣粘連蛋白(H-Cad/CDH13)elisa檢測試劑盒英文名稱：H-Cad/CDH13 ELISA Kit，H-Cad/CDH13，

CX3C趨化因子受體1(CX3CR1)elisa檢測試劑盒英文名稱：CX3CR1 ELISA Kit，CX3CR1，

B細胞受體相關蛋白31(BCAP31)elisa檢測試劑盒英文名稱：BCAP31 ELISA Kit，BCAP31，

Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)elisa檢測試劑盒英文名稱：Col Ⅲ ELISA Kit，Col Ⅲ，

3型1-磷suan鞘氨chun受體(S1P3)elisa檢測試劑盒英文名稱：S1P3 ELISA Kit，S1P3，

脂聯(lián)su(Adiponectin)elisa檢測試劑盒英文名稱：Adiponectin ELISA Kit，Adiponectin，

黑su瘤衍生亮氨suan拉鏈額外核因子(MLZE)elisa檢測試劑盒英文名稱：MLZE ELISA Kit，MLZE，

(GSH)elisa檢測試劑盒英文名稱：GSH ELISA Kit，GSH，

胱天蛋白mei激活的脫氧核糖核suanmei(CAD)elisa檢測試劑盒英文名稱：CAD ELISA Kit，CAD，
Caspase3/7活細胞熒光實時法檢測試劑盒哌拉西標準品規(guī)格:500mg 英文名稱：Piperacillin

環(huán)丙氨嗪標準品規(guī)格:200mg 英文名稱：Cyromazine

碘海chun標準品規(guī)格:200mg 英文名稱：Iohexol

jia磺suan培高利特標準品規(guī)格:200mg 英文名稱：Pergolide Mesylate

尼莫地標準品規(guī)格:125mg 英文名稱：Nimodipine

tong芬相關物質D標準品規(guī)格:20mg 英文名稱：

噻康zuo標準品規(guī)格:200mg 英文名稱：Tioconazole

benjiasuan標準品規(guī)格:300mg 英文名稱：Benzoic Acid

L-賴氨suan鹽suan鹽標準品規(guī)格:200mg 英文名稱：L-Lysine Hydrochloride

齊夫定相關物質C標準品規(guī)格:100mg 英文名稱：

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