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貨號(hào)	FS-X9662

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱：細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒IV(FITC+POD)

英文名稱：

產(chǎn)品規(guī)格：20T

貨號(hào)：FS-X9662

產(chǎn)品介紹:

保存條件：-20℃冰凍保存。

保存期：一年

工作原理：

在機(jī)體內(nèi)部隨時(shí)都在發(fā)生著細(xì)胞的死亡。傳統(tǒng)上用顯微鏡來(lái)觀察細(xì)胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時(shí)間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞自身的染色質(zhì)或DNA 被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與 DNA 斷點(diǎn)數(shù)目相同的3’-OH 末端。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以將標(biāo)記的dUTP(DIG-dUTP)標(biāo)記至 3’-OH 末端，DIG-dUTP 結(jié)合在 DNA 斷點(diǎn)部位，可以通過(guò)生物標(biāo)記的抗抗體(Anti-DIG-Biotin)反應(yīng)后，再結(jié)合熒光素 FITC或者過(guò)氧化物酶 POD 標(biāo)記的鏈酶親和素(SABC-FITC/SABC-POD)。FITC 在 490-495nm 激化，在 520-530nm 發(fā)射熒光，在熒光顯微鏡下呈明亮黃綠色。POD的在加入顯色底物 DAB 顯色后，凋亡的細(xì)胞核呈棕黃色。用戶根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，在不同切片上用兩套不同顯示系統(tǒng)觀察。

試劑盒內(nèi)容：

1．標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer)1ml

2．末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT,×20)20μl

3．DIG-dUTP(×20)20μl

4．封閉液(Blocking Reagent)4ml

5．生物su化抗抗體(× 100)20μl

6．SABC-FITC(× 100)20μl

7．SABC-POD(× 100)20μl

8．Proteinase K(×200)50μl

9．抗體稀釋液 4ml

10．未染色陽(yáng)性對(duì)照片 2 張。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

組蛋白脫乙?；?/span>mei5(HDAC5)檢測(cè)試劑盒 forHistoneDeacetylase5(HDAC5)

內(nèi)分泌腺來(lái)源血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(EG-VEGF)檢測(cè)試劑盒 forEndocrineGlandDerivedVascularEndothelialGrowthFactor(EG-VEGF)

肌球蛋白重鏈7(MYH7)檢測(cè)試劑盒 forMyosinHeavyChain7,CardiacMuscle,Beta(MYH7)

脂su3(LPIN3)檢測(cè)試劑盒 forLipin3(LPIN3)

血管緊張su原(AGT)檢測(cè)試劑盒 forAngiotensinogen(AGT)

著絲粒蛋白I(CENPI)檢測(cè)試劑盒 forCentromereProteinI(CENPI)

多型性腺瘤基因樣蛋白1(PLAGL1)檢測(cè)試劑盒 forPleiomorphicAdenomaGeneLikeProtein1(PLAGL1)

骨成型蛋白4(BMP4)檢測(cè)試劑盒 forBoneMorphogeneticProtein4(BMP4)

乙chun脫氫mei6(ADH6)檢測(cè)試劑盒 forAlcoholDehydrogenase6(ADH6)

骨成型蛋白受體1A(BMPR1A)檢測(cè)試劑盒 forBoneMorphogeneticProteinReceptor1A(BMPR1A)

涎福林蛋白(SPN)檢測(cè)試劑盒 forSialophorin(SPN)

脂聯(lián)su受體1(ADIPOR1)檢測(cè)試劑盒 forAdiponectinReceptor1(ADIPOR1)

低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1α)檢測(cè)試劑盒 forHypoxiaInducibleFactor1Alpha(HIF1a)

中性粒細(xì)胞彈性蛋白mei(ELA2)檢測(cè)試劑盒 forElastase2,Neutrophil(ELA2)

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)檢測(cè)試劑盒 forBrainDerivedNeurotrophicFactor(BDNF)

鈉/鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATPmeiβ3肽(ATP1β3)檢測(cè)試劑盒 forATPase,Na+/K+TransportingBeta3Polypeptide(ATP1b3)

血管緊張suⅡ(ANGⅡ)檢測(cè)試劑盒 forAngiotensinII(AngII)
細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒IV(FITC+POD)醋suan胍那芐標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Guanabenz Acetate

鹽suan利托君標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Ritodrine Hydrochloride

哈拉標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Halazepam CIV (AS)

左美諾chun標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：Levomenol

鹽suanjiaben噻嗪標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Xylazine Hydrochloride

葡庚糖suan紅霉su標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Erythromycin Gluceptate

咪康zuo標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Miconazole

水飛薊su標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：Silybin

zuo來(lái)瞵suan相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:30mg 英文名稱：

碘昔蘭相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：Ioxilan Related Compound A
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)