細胞凋亡檢測試劑盒III(FITC)-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9660

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

中文名稱：細胞凋亡檢測試劑盒III(FITC)

英文名稱：

產品規(guī)格：20T

貨號：FS-X9660

產品介紹:

保存條件：-20℃冰凍保存一年。

工作原理：

在機體內部隨時都在發(fā)生著細胞的死亡。傳統(tǒng)上用顯微鏡來觀察細胞的死亡，其特征為核染色質的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時間也很短暫。凋亡的特征是內源性核酸內切酶被激活，細胞自身的染色質或DNA 被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產生與 DNA 斷點數(shù)目相同的3’-OH 末端。末端脫氧核糖核酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以將標記的dUTP(DIG-dUTP)標記至 3’-OH 末端，DIG-dUTP 結合在 DNA 斷點部位，可以通過生物標記的抗抗體(Anti-DIG-Biotin)反應后，再結合鏈酶親和素-熒光素 FITC(SABC-FITC)。FITC 在 490-495nm 激化，在 520-530nm 發(fā)射熒光，呈黃綠色。凋亡的細包核呈黃綠色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細胞。

試劑盒內容：

1．標記緩沖液(Labeling Buffer)1ml

2．末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT,×20)20μl

3．DIG-dUTP(×20)20μl

4．封閉液(Blocking Reagent)4ml

5．生物素化抗抗體(× 100)20μl

6．SABC-FITC(× 100)20μl

7．Proteinase K(×200)50μl

8．抗體稀釋液 4ml

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

蛋白激meiR(PKR)檢測試劑盒 forProteinKinaseR(PKR)

分泌型卷曲相關蛋白2(SFRP2)檢測試劑盒 forSecretedFrizzledRelatedProtein2(SFRP2)

白介su17(IL17)檢測試劑盒 forInterleukin17(IL17)

封閉蛋白9(CLDN9)檢測試劑盒 forClaudin9(CLDN9)

輔激活因子激活因子(COAA)檢測試劑盒 forCoactivatorActivator(COAA)

Fission1蛋白(FIS1)檢測試劑盒 forFission1(FIS1)

神經調節(jié)su3(NRG3)檢測試劑盒 forNeuregulin3(NRG3)

卷曲同源物4(FZD4)檢測試劑盒 forFrizzledHomolog4(FZD4)

70kDa熱休克蛋白8(HSPA8)檢測試劑盒 forHeatShock70kDaProtein8(HSPA8)

趨化su(CHEM)檢測試劑盒 forChemerin(CHEM)

抑絲蛋白1(PFN1)檢測試劑盒 forProfilin1(PFN1)

蛙皮su6-14(BB)檢測試劑盒 forBombesin6-14(BB)

鈣蛋白mei14(CAPN14)檢測試劑盒 forCalpain14(CAPN14)

脫氨mei(GDA)檢測試劑盒 forGuanineDeaminase(GDA)

ⅩⅢ(F13)檢測試劑盒 forCoagulationFactorXIII(F13)

谷氨suan脫羧mei2(GAD2)檢測試劑盒 forGlutamateDecarboxylase2,Acid(GAD2)

血紅蛋白(HB)檢測試劑盒 forHemoglobin(HB)
細胞凋亡檢測試劑盒III(FITC)馬來suan右lvben那敏標準品規(guī)格:300mg 英文名稱：Dexchlorpheniramine Maleate

阿糖腺標準品規(guī)格:200mg 英文名稱：Vidarabine

匹林鈉標準品規(guī)格:500mg 英文名稱：Cephapirin Sodium

二十三suanjia酯標準品規(guī)格:200mg 英文名稱：Methyl Tricosanoate

替莫zuoan相關物質A標準品規(guī)格:15mg 英文名稱：

馬來suan單十八酯標準品規(guī)格:100mg 英文名稱：Monostearyl Maleate

jia氨蝶呤相關物質C標準品規(guī)格:50mg 英文名稱：

托萘酯標準品規(guī)格:200mg 英文名稱：Tolnaftate

2-脫氧-2-fu-D-葡萄糖相關物質A標準品

規(guī)格:15mg 英文名稱：

阿替卡因標準品規(guī)格:40mg 英文名稱：Articaine
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)