阿爾瑪藍(lán)-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9655

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱：阿爾瑪藍(lán)

英文名稱：Alamar Blue

產(chǎn)品規(guī)格：100T

貨號(hào)：FS-X9655

產(chǎn)品介紹:

阿爾瑪藍(lán)（Alamar Blue）是一種氧化還原指示劑，能根據(jù)代謝活性產(chǎn)生吸亮度變化和熒光信號(hào)。這是一種安全無(wú)毒的染料，可用于細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖的定量分析以及細(xì)胞因子生物測(cè)定和體外細(xì)胞毒性研究，能有效測(cè)定動(dòng)物、真菌和細(xì)菌細(xì)胞的天然代謝活性。Alamar Blue在氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)紫藍(lán)色無(wú)熒光性，而在還原狀態(tài)下，轉(zhuǎn)變?yōu)槌史奂t或紅色熒光的還原產(chǎn)物，反映所研究的細(xì)胞或微生物對(duì)氧分子的消耗，因而常被用作氧化還原指示劑，以顯示被觀察細(xì)胞和細(xì)菌的代謝活動(dòng)。這種測(cè)定是基于具有代謝活性的細(xì)胞將試劑轉(zhuǎn)換成熒光和比色指示劑的能力。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，處于還原環(huán)境。攝入細(xì)胞內(nèi)的染料被這些代謝中間體及細(xì)胞色素類(lèi)還原后釋放到細(xì)胞外并溶于培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基從無(wú)熒光的靛青藍(lán)變成有熒光的粉紅色。受損和無(wú)活性細(xì)胞具有較低的天然代謝活性，因此對(duì)應(yīng)的信號(hào)較低?？梢杂闷胀ǚ止夤舛扔?jì)或熒光光度計(jì)檢測(cè)，其激發(fā)光波長(zhǎng)在530-560 nm之間，發(fā)射光波長(zhǎng)為590 nm。吸光度和熒光強(qiáng)度與活性細(xì)胞數(shù)成正比。

本品可廣泛地用于細(xì)胞增殖代謝，藥物的細(xì)胞毒作用的體外測(cè)定以及病原微生物的的快速檢測(cè)與鑒定。與臺(tái)盼蘭、TTC、MTT、MTS等分析法相比，Alamar Blue具有更多的優(yōu)勢(shì)。Alamar Blue采用單一試劑，可以連續(xù)、快速地檢測(cè)細(xì)胞的增生狀態(tài)。由于Alamar Blue對(duì)細(xì)胞無(wú)毒、無(wú)害，不影響細(xì)胞的抗體合成與分泌等活性，因此可以對(duì)同一批細(xì)胞的增生狀態(tài)進(jìn)行連續(xù)觀察和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察，因此有操作簡(jiǎn)便和幾乎不干擾細(xì)胞正常代謝的特點(diǎn)。

注意事項(xiàng)

1）需客戶自行準(zhǔn)備100%還原型Alamar Blue試劑。為得到還原型Alamar Blue，需配制Alamar Blue與細(xì)胞培養(yǎng)基的混合溶液，Alamar Blue與細(xì)胞培養(yǎng)基的比值為1:10，高壓滅菌15min。（不能對(duì)濃縮的Alamar Blue高壓滅菌，也不能用PBS配制溶液，因?yàn)?00%還原型Alamar Blue在PBS中不穩(wěn)定。）

2）為得到結(jié)果，建議實(shí)驗(yàn)前先摸索孵育時(shí)間和接種細(xì)胞數(shù)量。

3）合適密度的細(xì)胞可以增加檢測(cè)靈敏度。對(duì)于96 孔板，我們建議每孔接種100 微升細(xì)胞，細(xì)胞濃度范圍為：貼壁細(xì)胞在100-10,000/孔，懸浮細(xì)胞在2,000-50,000/孔，并以培養(yǎng)基為空白對(duì)照。對(duì)于384 孔板，細(xì)胞濃度和接種量均減半。

4）整個(gè)過(guò)程均應(yīng)為無(wú)菌操作，因?yàn)槲⑸镂廴疚锿瑯涌梢赃€原檢測(cè)試劑而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5）注意接種細(xì)胞濃度和加入檢測(cè)試劑后孵育時(shí)間。細(xì)胞濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性還原反應(yīng)，產(chǎn)生無(wú)色和熒光消失。

6）孵育時(shí)，須避光。

7）本產(chǎn)品可以使用熒光或分光光度計(jì)檢測(cè)，但熒光的靈敏度高，實(shí)驗(yàn)誤差小，推薦使用熒光檢測(cè)。

儲(chǔ)存條件：4℃，有效期一年

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

轉(zhuǎn)化受體電位陽(yáng)離子通道亞家族M成員1(TRPM1)檢測(cè)試劑盒 forTransientReceptorPotentialCationChannelSubfamilyM,Member1(TRPM1)

Ⅶ(F7)檢測(cè)試劑盒 forCoagulationFactorVII(F7)

泛su(Ub)檢測(cè)試劑盒 forUbiquitin(Ub)

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存蛋白2(SMN2)檢測(cè)試劑盒 forSurvivalOfMotorNeuron2,Centromeric(SMN2)

絲氨suan蛋白mei23(PRSS3)檢測(cè)試劑盒 forProtease,Serine3(PRSS3)

羥賴氨suan(Hyl)檢測(cè)試劑盒 forHydroxylysine(Hyl)

細(xì)胞色sub-245β肽(CYBβ)檢測(cè)試劑盒 forCytochromeb-245BetaPolypeptide(CYBb)

谷丙轉(zhuǎn)氨mei(ALT)檢測(cè)試劑盒 forAlanineAminotransferase(ALT)

CD19分子(CD19)檢測(cè)試劑盒 forClusterOfDifferentiation19(CD19)

基質(zhì)金屬蛋白mei24(MMP24)檢測(cè)試劑盒 forMatrixMetalloproteinase24(MMP24)

磷suanmei張力蛋白同源物(PTEN)檢測(cè)試劑盒 forPhosphataseAndTensinHomolog(PTEN)

信號(hào)su4A(SEMA4A)檢測(cè)試劑盒 forSemaphorin4A(SEMA4A)

肌球蛋白ⅠF(MYO1F)檢測(cè)試劑盒 forMyosinIF(MYO1F)

玻連蛋白(VTN)檢測(cè)試劑盒 forVitronectin(VTN)

T-細(xì)胞激活連接蛋白(LAT)檢測(cè)試劑盒 forLinkerForActivationOfT-Cell(LAT)

心肌肌鈣蛋白T(TNNT2)檢測(cè)試劑盒 forTroponinTType2,Cardiac(TNNT2)

凝溶膠蛋白(GS)檢測(cè)試劑盒 forGelsolin(GS)
阿爾瑪藍(lán)碘克沙chun相關(guān)物質(zhì)E標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:25mg 英文名稱：

夫定相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:25mg 英文名稱：

鹽suan克林霉su棕櫚酯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：

甘油單油suan酯90％標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:250mg 英文名稱：Glyceryl Monooleate 90%

甘油單油suan酯40％標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Glyceryl Monooleate 40％

替硝zuo相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:20mg 英文名稱：Tinidazole Related Compound B

鹽suan曲zuotong標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Trazodone Hydrochloride

聚乙二chun200標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1g 英文名稱：Polyethylene Glycol 200

聚乙二chun300標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1g 英文名稱：Polyethylene Glycol 300

聚乙二chun400標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1g 英文名稱：Polyethylene Glycol 400
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)