Caspase 9熒光法檢測(cè)試劑盒(AFC)-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9579

英文名稱：Caspase-9 Fluorescence Metric Assay

產(chǎn)品規(guī)格：20T|50T|100T

貨號(hào)：FS-X9579

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒適用于培養(yǎng)細(xì)胞及新鮮組織Caspase-9 檢測(cè)。Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中Caspase-9 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，與DNA 斷裂、染色質(zhì)凝聚和凋亡小體形成有關(guān)。Caspase-9 在正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于胞漿中，沒有活性；但在細(xì)胞發(fā)生凋亡階段，它被激活，活化的Caspase-9 由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-9 熒光檢測(cè)試劑盒就是將Caspase-9 序列特異性的多肽偶聯(lián)至發(fā)色基團(tuán)。當(dāng)?shù)孜锉籆aspase-9 剪切后，發(fā)色基團(tuán)即游離出來(lái)，可通過(guò)熒光酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)=485nm,發(fā)射波長(zhǎng)=535nm）。

注意事項(xiàng)

1. Caspase-9 Substrate 避光保存及使用。

2. 對(duì)某些凋亡誘導(dǎo)劑引起的細(xì)胞凋亡可能存在非依賴于Caspase-9 活化的機(jī)制，這種情況時(shí)利用本試劑盒檢測(cè)Caspase-9 活性無(wú)明顯改變，需要考慮凋亡機(jī)制中的其他信號(hào)通路。

3. 細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到3～5×106 個(gè)或新鮮組織50~100mg，以便能達(dá)到測(cè)定需要的100～200μg 蛋白的要求，因?yàn)镃aspase-9 的活性與細(xì)胞裂解液的蛋白含量有關(guān)，如測(cè)定的RFU 值偏低，可以通過(guò)適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)的時(shí)間，如果值還是不高，可通過(guò)增加細(xì)胞數(shù)量或組織量的方法來(lái)提高蛋白量。

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

Ⅹ(F10)檢測(cè)試劑盒 forCoagulationFactorX(F10)

基質(zhì)金屬蛋白mei7(MMP7)檢測(cè)試劑盒 forMatrixMetalloproteinase7(MMP7)

半乳凝su2(GAL2)檢測(cè)試劑盒 forGalectin2(GAL2)

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白11(GLUT11)檢測(cè)試劑盒 forGlucoseTransporter11(GLUT11)

受體活性修飾蛋白2(RAMP2)檢測(cè)試劑盒 forReceptorActivityModifyingProtein2(RAMP2)

T-細(xì)胞可誘導(dǎo)共刺激分子配體(ICOSLG)檢測(cè)試劑盒 forInducibleT-CellCoStimulatorLigand(ICOSLG) 乳suan脫氫meiB(LDHB)檢測(cè)試劑盒 forLactateDehydrogenaseB(LDHB)

內(nèi)皮細(xì)胞TEK酪氨suan激mei(Tie2)檢測(cè)試劑盒 forTEKTyrosineKinase,Endothelial(Tie2)

微管蛋白β1(TUBβ1)檢測(cè)試劑盒 forTubulinBeta1(TUBb1)

轉(zhuǎn)錄激活因子7(ATF7)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ATF7 ELISA Kit，ATF7，

脂質(zhì)運(yùn)載蛋白10(LCN10)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：LCN10 ELISA Kit，LCN10，

周期su依賴性激mei4(CDK4)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CDK4 ELISA Kit，CDK4，

整合suα5(ITGα5)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ITGα5 ELISA Kit，ITGα5，

早期生長(zhǎng)應(yīng)答因子3(EGR3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：EGR3 ELISA Kit，EGR3，

原肌球蛋白4(TPM4)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：TPM4 ELISA Kit，TPM4，

原鈣黏su12(PCDH12)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：PCDH12 ELISA Kit，PCDH12，

乙酰輔meiA乙酰轉(zhuǎn)移mei2(ACAT2)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ACAT2 ELISA Kit，ACAT2，
Caspase 9熒光法檢測(cè)試劑盒(AFC)加巴噴相關(guān)物質(zhì)E標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:25mg 英文名稱：

阿lvmi松雙丙suan酯標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:300mg 英文名稱：Alclometasone Dipropionate

羥氨芐junsu標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Cefadroxil

佛si可林標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:40mg 英文名稱：Forskolin

鹽suan金剛烷an標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Amantadine Hydrochloride

非諾芬鈉標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Fenoprofen Sodium

美比達(dá)相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:15mg 英文名稱：

鹽suan雷尼替標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Ranitidine Hydrochloride

相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:10mg 英文名稱：

鹽suan替安標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:325mg 英文名稱：Cefotiam Hydrochloride