Caspase-1活性測定試劑盒-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9740

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：Caspase-1活性測定試劑盒

英文名稱：Caspase 1 Activity colorimetric assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20T|50T|100T

貨號：FS-X9740

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒適用于測定哺乳動物組織、細(xì)胞caspase-1活性。測定原理基于Caspase-1特異水解其多肽底物N-acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp-pNA(Ac-YVAD-pNA)，釋放出游離的硝基pNA，后者呈黃色在405nm具有大吸收峰，用可見光分光光度比色方法測定。其吸光度值對應(yīng)于Caspase-1的水解活性。

細(xì)胞凋亡屬于程序化細(xì)胞死亡，可見于各種器官和細(xì)胞，在正常發(fā)育、生理、病理過程中對細(xì)胞和器官的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是參與細(xì)胞凋亡過程的蛋白酶家族，包含10多個成員。其中Caspase-1是可剪切IL-1b和IL-18前體產(chǎn)生活性細(xì)胞因子的caspase。Caspase-11剪切45kD的caspase-1前體蛋白產(chǎn)生20kD和10kD片斷，這兩個片斷可以形成異源二聚體，并進一步形成四聚體。此四聚體具有蛋白酶活性。Caspase-1通過剪切Bcl-XL調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，并通過對細(xì)胞因子前體的剪切來調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)。

運輸及保存：試劑常溫運輸。到達后按要求儲存，1年內(nèi)穩(wěn)定。

所需儀器：酶標(biāo)儀與96孔酶標(biāo)板；或可見光分光光度計配100μl容積的石英比色杯。

工作波長：大吸收波長405nm，如不具備也可在400～450nm范圍內(nèi)測定，但靈敏度略降。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

25羥基維生D3(25(OH)D3/25 HVD3)英文名：25(OH)D3/25 HVD3 Bcl2樣凋亡蛋白14抗體包裝5g

25羥基維生D3(25 HVD3)英文名：25 HVD3 Bcl2蛋白修飾因子抗體包裝1g

25羥基膽固(25-OHC)英文名：25-OHC 骨形態(tài)發(fā)生蛋白11抗體包裝5g

20S蛋白體(20SP)英文名：20SP BCL2樣15促凋亡蛋白抗體包裝25g

17-類固(17-KS)英文名：17-KS 骨堿性磷抗體包裝100g

17羥孕(17-OHP)英文名：17-OHP 磷化T淋巴連接蛋白抗體包裝25g

17羥皮質(zhì)類固(17-OHCS)英文名：17-OHCS 磷化T淋巴連接蛋白抗體包裝500g

17-α睪(17-αMT)英文名：17-αMT 腦納前體抗體包裝10MG

16α羥基雌1(16-α OHE-1)英文名：16-α OHE-1 腦納前體抗體包裝100mL

15脂加氧(15-LO/LOX)英文名：15-LO/LOX 骨髓基質(zhì)干抗原1抗體包裝25mL

12羥二十烷四烯(12-HETE)英文名：12-HETE 磷化蛋白酪激ATK抗體包裝1g

1,4,5-三磷肌(IP3)英文名：IP3 磷化蛋白酪激ATK抗體包裝5g

1,3-βD葡葡糖苷(1,3-βD-Glu)英文名：1,3-βD-Glu 磷化相關(guān)死亡促進因子抗體包裝100ml

1,25二羥基維生D3(1,25 DHVD3)英文名：1,25 DHVD3 磷化死亡調(diào)解子抗體包裝1g

組織蛋白B(CTSB)英文名：CTSB 磷化死亡調(diào)解子抗體包裝250mg

甘油酯激線粒體抗體基質(zhì)金屬蛋白3(MMP3)PTZ-343 is a phenothiazine derivative with chemical name: sodium 3-(10H-phenothi
Caspase-1活性測定試劑盒果形正青霉檸檬酸甜菜堿麻疹病IgG抗體

假結(jié)核耶爾森氏 4-頻哪酯毛球族同族體1

土地桿 3,5-二氟-4-溴苯毛球族同族體2

哈茨木霉 4-甲氧基苯基酸頻那酯毛球族同族體3

曲霉 4-基-3-氟門

美澳型核果褐腐病 1,8-二溴萘門冬酰

腐皮殼 3,4,5-三溴吡唑錳超氧化物歧化

綠色鏈霉 2-氟-5-吡啶球蛋白A

微小桿 5-靛紅球蛋白A1

靈芝 4-溴-2-甲氧基芐球蛋白D

水溶性非食用色快速篩查盒 3,5-雙(叔丁基)苯甲球蛋白E

蟬擬青霉 2-氟-4-酸球蛋白E Fc段受體Ⅰ

高地芽孢桿 2-基-4-硝基-6-溴苯球蛋白G

平菇 (S)-(-)-b-乙球蛋白G1

蠟樣芽孢桿反式-肉桂酰球蛋白G2
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)