Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9560

產(chǎn)品介紹:

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨suan（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨suan（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V 是一種分子量為35~36kD 的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨suan有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨suan與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V 進(jìn)行熒光素FITC 標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V 作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI 能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V 與PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。

本試劑盒可應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)（不推薦用于檢測(cè)組織樣本）。

中文名稱：Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒

英文名稱：Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：10T|20T|50T|100T

貨號(hào)：FS-X9560

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

類粘蛋白(ORM)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ORM ELISA Kit，ORM，

人抗著絲點(diǎn)抗體(ACA/CENP)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ACA/CENP ELISA Kit，ACA/CENP，

人抗神經(jīng)元核抗體1型/抗Hu抗體(ANNA-1/Hu)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ANNA-1/Hu ELISA Kit，ANNA-1/Hu，

人抗jia狀腺球蛋白抗體(ATGA/TGAB)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ATGA/TGAB ELISA Kit，ATGA/TGAB，

人抗sp100抗體(sp100)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：sp100 ELISA Kit，sp100，

緊密連接蛋白1(ZO1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ZO1 ELISA Kit，ZO1，

性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子6(bFGF-6)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：bFGF-6 ELISA Kit，bFGF-6，

激動(dòng)異構(gòu)mei/細(xì)胞分裂suMB(CKMB)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CKMB ELISA Kit，CKMB，

肌肉骨骼受體酪氨suan激mei抗體(MUSK Ab)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：MUSK Ab ELISA Kit，MUSK Ab，

維生suE(VE)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：VE ELISA Kit，VE，

糖蛋白130(gp130)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：gp130 ELISA Kit，gp130，

透明質(zhì)suan結(jié)合蛋白(HABP)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：HABP ELISA Kit，HABP，

髓過氧化物mei特異性抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體IgG(MPO-ANCA IgG)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：MPO-ANCA IgG ELISA Kit，MPO-ANCA IgG，

受體型酪氨suan蛋白磷suanmei樣N(PTPRN)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：PTPRN ELISA Kit，PTPRN，

腎上腺髓質(zhì)su(ADM)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ADM ELISA Kit，ADM，

沙眼衣原體抗體(CT)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CT ELISA Kit，CT，

熱休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：HSP gp96 ELISA Kit，HSP gp96，
Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒3-jia氧基酪氨suan標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：

碘普羅an相關(guān)物質(zhì)B標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：

鹽suan標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱：Cathinone Hydrochloride CI

曲安na德標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Triamcinolone Acetonide

克利溴an標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Clidinium Bromide

馬來suan依那普利標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Enalapril Maleate

β-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:250mg 英文名稱：Beta Cyclodextrin

利塞膦suan相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:20mg 英文名稱：

鹽suanjia肟標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:350mg 英文名稱：Cefmenoxime Hydrochloride

來fumi特標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Leflunomide