Caspase-5活性測定試劑盒-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9736

英文名稱：Caspase-5 Activity colorimetric assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20T|50T|100T

貨號：FS-X9736

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒適用于測定哺乳動物組織、細胞caspase-5活性。試劑盒測定原理基于Caspase-5特異水解其多肽底物N-acetyl-Trp-Glu-His-Asp-p-nitroanilide(Ac-WEHD-pNA)，釋放出游離的硝基pNA，后者呈黃色在405nm具有大吸收峰，用可見光分光光度比色方法測定，吸光度值對應于Caspase-5的水解活性。

細胞凋亡屬于程序化細胞死亡，可見于各種器官和細胞，在正常發(fā)育、生理、病理過程中對細胞和器官的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是參與細胞凋亡過程的蛋白酶家族，包含10多個成員。Caspase-5分子量47.7kD，與ICE有51%的同源性，在過量表達時可誘導凋亡發(fā)生。

所需儀器：酶標儀與96孔酶標板；或可見光分光光度計配100μl容積的石英比色杯。

工作波長：大吸收波長405nm，如不具備也可在400～450nm范圍內(nèi)測定。

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

DAB2互作蛋白(DAB2IP)英文名：DAB2IP 磷化癌易感基因1抗體包裝100mg

C型鈉尿肽(CNP)英文名：CNP 磷化癌易感基因1抗體包裝25mg

C肽(C-Peptide)英文名：C-Peptide 磷化非受體性蛋白酪激ETK抗體包裝1g

C反應蛋白(CRP)英文名：CRP 磷化B-Raf抗體包裝5g

CXC趨化因子受體4(CXCR4)英文名：CXCR4 癌易感基因相互作用蛋白1抗體包裝500g

CXC趨化因子受體3(CXCR3)英文名：CXCR3 磷化癌易感基因相互作用蛋白1抗體包裝100g

CXC趨化因子配體16(CXCL16)英文名：CXCL16 磷化相關死亡促進因子抗體包裝500g

CXC趨化因子13(Cxcl13/Blc/Scyb13)英文名：Cxcl13/Blc/Scyb13 磷化BH3結(jié)構域凋亡誘導蛋白抗體包裝1g

CD8分子(CD8)英文名：CD8 磷化BH3結(jié)構域凋亡誘導蛋白抗體包裝1g

CD4分子(CD4)英文名：CD4 磷化B-Raf抗體包裝1g

CD45分子(CD45)英文名：CD45 磷化B-Raf抗體包裝25g

CD44分子(CD44)英文名：CD44 磷化Bcl-xL蛋白抗體包裝5g

CD3分子(CD3)英文名：CD3 高表達神經(jīng)上皮蛋白BTG3抗體包裝1g

CD34分子(CD34)英文名：CD34 B遷移基因4抗體包裝25g

CD33分子(CD33)英文名：CD33 BCL2相互作用蛋白質(zhì)抗體包裝5g

血管內(nèi)皮遷移蛋白抗體肝核因子1β(HNF1β)Deltarasin is a small molecular inhibitor of KRAS-PDEδ interaction with Kd of 38
Caspase-5活性測定試劑盒*正紅菇 5-溴-2-甲酯類固5α還原2

豬丹絲 2-基吡類趨化因子受體CMLR1

密蘇里游動放線 (S)-2-甲基吡咯烷鹽酸鹽類胰蛋白

粉紅單端孢霉 3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸冷球蛋白

釀酒酵母 N-Boc-3-甲基-4-酮冷誘導RNA結(jié)合蛋白

蠟狀芽孢桿 3-溴-4-吡啶鹽酸鹽利什曼原蟲抗體

根瘤 4-氟-D-苯氨酸粒集落激因子

腸沙門氏腸炎亞種硫酸原黃粒巨噬集落激因子

面粉增白劑速測卡 6-溴-2-喹啉連接蛋白-1

桔橙鏈霉 1,7-二旋氧雜［5.5］十一烷鏈激

Pilidium concavum 4-氟-3-甲酸甲酯亮氨肽

藻渣梭 4-氟-2-甲酸甲酯酸腦啡肽

煙曲霉 2-(4-甲基-1-哌)苯磷酸苷油酸脫氫

黑色小單孢 3,4-二芐氧基磷酸果糖激

莖生擬莖點霉 4-三乙氧硅基聯(lián)苯磷酸化AKT蛋白

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