Caspase-6活性測定試劑盒-上海撫生實業(yè)有限公司

貨號	FS-X9735

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：Caspase-6活性測定試劑盒

英文名稱：Caspase-6 Activity colorimetric assay Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20T|50T|100T

貨號：FS-X9735

產(chǎn)品介紹:

本試劑盒測定哺乳動物組織、細(xì)胞caspase-6活性。試劑盒測定原理基于Caspase-6特異水解其多肽底物Ac-VEID-pNA(N-acetyl-Val-Glu-Ile-Asp-p-nitroanilide)，釋放出游離的硝基pNA，后者呈黃色在405nm具有大吸收峰，用可見光分光光度比色方法測定。其吸光度值對應(yīng)于Caspase-6的水解活性。

Caspase-6也稱Mch-2，其前體蛋白被granzyme B剪切后形成活化的caspase-6二聚體，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡屬于程序化細(xì)胞死亡，可見于各種器官和細(xì)胞，在正常發(fā)育、生理、病理過程中對細(xì)胞和器官的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是參與細(xì)胞凋亡過程的蛋白酶家族，包含10多個成員。Caspase-6也稱Mch-2，其前體蛋白被granzyme B剪切后形成活化的caspase-6二聚體，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-6可剪切凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白PARP，剪切核膜上關(guān)鍵蛋白Lamin A，其對于Lamin A的識別位點(diǎn)是VEID。

運(yùn)輸及保存：試劑常溫運(yùn)輸。到達(dá)后按要求儲存，1年內(nèi)穩(wěn)定。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

III型前膠原基末端肽(PⅢNP)英文名：PⅢNP Bcl2相互作用蛋白1抗體（轉(zhuǎn)化相關(guān)基因8蛋白）包裝100g

G蛋白偶聯(lián)膽汁受體1(GPBAR1)英文名：GPBAR1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白5抗體包裝25g

GATA結(jié)合蛋白4(GATA4)英文名：GATA4 骨形態(tài)發(fā)生蛋白15抗體包裝1g

FMS樣酪激3配體(Flt3L)英文名：Flt3L Bcl-2樣蛋白2抗體包裝250mg

FMS樣酪激3(Flt3)英文名：Flt3 殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白抗體包裝5g

FAM84A蛋白(FAM84A)英文名：FAM84A Bcl-2抗體包裝25g

FAM172A蛋白(FAM172A)英文名：FAM172A 腦轉(zhuǎn)錄因子4蛋白抗體包裝5g

E選擇(E-Selectin/CD62E)英文名：E-Selectin/CD62E 膽鹽激活脂肪抗體包裝1mg

E鈣粘著蛋白/上皮性鈣黏附蛋白(E-Cad)英文名：E-Cad 3-羥丁脫氫抗體包裝25g

E3泛蛋白連接TRIM68(TRIM68)英文名：TRIM68 長鏈脂肪?；饪贵w包裝5g

D-乳脫氫(D-LDH)英文名：D-LDH 磷化癌易感基因1抗體包裝10mg

D二聚體(D2D)英文名：D2D 磷化β分泌抗體包裝50mg

DNA(胞嘧啶-5)基轉(zhuǎn)移3B(DNMT3B)英文名：DNMT3B 磷化相關(guān)死亡促進(jìn)因子抗體包裝1g

DNA(胞嘧啶-5)基轉(zhuǎn)移3A(DNMT3A)英文名：DNMT3A 磷化相關(guān)死亡促進(jìn)因子抗體包裝25g

DNA(胞嘧啶-5)基轉(zhuǎn)移1(DNMT1)英文名：DNMT1 磷化Bcl-2抗體包裝5g

芳香乙酰脫乙?；鶚拥鞍?/span>2抗體肝核因子1β(HNF1β)LCL161 is an orally bioavailable second mitochondrial-derived activator of caspa
Caspase-6活性測定試劑盒ATCC 10211 氧基硅醌氧化還原1

斜頂 4-二基丁縮二甲賴氨酰氧化

相思根瘤 2-(基硅基)噻吩蛋白激

聚貪氏 3,5-二叔丁基水楊酸酪蛋白激受體A2

枯草芽孢桿對甲草酸二酯酪酸蛋白激受體A7抗體

Nocardioides 4-乙氧基-1-萘甲酸酪

非脫羧勒克 N-叔丁氧羰基-5-溴酪酸激2

枯草芽孢桿 2,8-二甲基-2,3,4,5-四氫-1H-吡啶并[4,3-b]酪酸激受體

球孢白僵 6-羥基吡啶-2-羧酸

赭色擲孢酵母 9,9-二辛基芴-2,7-雙(酸頻哪酯)酪酸羥化

釀酒酵母 N-環(huán)戊基甘甲酯鹽酸鹽酪氨酰DNA 磷酸二酯1

美澳型核果褐腐病鄰芐氧苯酪酪肽；多肽YY

耶納農(nóng)球 4,6-二甲基-2-庚酮雷帕霉靶蛋白

枯草芽孢桿 3,4-二羥基噻吩-2,5-二羧酸二乙酯類白抗原C

Bacillus tequilensis 4--3-鹽酸鹽類風(fēng)濕因子
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)