【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】細(xì)胞是生命活動的基本單位。每時每刻，人體內(nèi)都在上演著大量不同類型細(xì)胞間交互作用所形成的交響曲。然而，在這一連接微觀與宏觀之間的介觀尺度上，卻存在巨大的技術(shù)空白，使得當(dāng)前研究難以在哺乳動物的活體環(huán)境器官尺度下同時觀測大量細(xì)胞在不同生理與病理狀態(tài)下的時空異質(zhì)性，極大限制了腦科學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科發(fā)展。僅以腦科學(xué)為例，大量神經(jīng)元間的相互連接和作用涌現(xiàn)出如智能、意識等功能，厘清神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)和活動規(guī)律是解析大腦工作原理的必由之路。然而具備單神經(jīng)元識別能力的傳統(tǒng)顯微鏡往往只具備毫米級視場，僅能覆蓋小鼠單個或幾個腦區(qū)實現(xiàn)單個平面的神經(jīng)信號動態(tài)記錄；功能核磁雖然能夠?qū)崿F(xiàn)三維全腦范圍觀測，但空間分辨率卻遠(yuǎn)不足以識別單細(xì)胞。因此，2013年啟動的美國腦計劃也將“大規(guī)模神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)記錄技術(shù)”列為九大資助領(lǐng)域之一。同樣，對于腫瘤學(xué)而言，只有兼具大視場與高分辨才能全景式捕捉腫瘤發(fā)生發(fā)展的完整過程，從而更精準(zhǔn)地研究不同藥物反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點。
 

　　瞄準(zhǔn)這一國際前沿難題，清華大學(xué)戴瓊海院士團(tuán)隊早在2013年就獲得了國家自然科學(xué)基金委重大科研儀器研制項目支持，在國際上率先開展了介觀活體顯微成像領(lǐng)域研究，并于2018年成功研制了國際首臺億像素介觀熒光顯微儀器RUSH，能夠同時兼具厘米級視場與亞細(xì)胞分辨率。盡管這一系統(tǒng)被國際同行譽(yù)為介觀顯微成像領(lǐng)域的先驅(qū)，但是由于儀器復(fù)雜昂貴，在當(dāng)時僅能被少數(shù)科學(xué)家使用。與此同時，RUSH系統(tǒng)仍然面臨一系列瓶頸，包括：如何利用二維傳感器實現(xiàn)高速三維成像；如何避免激光長時間照射所引起的細(xì)胞損傷(即光毒性)從而實現(xiàn)長時程高速觀測；如何克服復(fù)雜成像環(huán)境導(dǎo)致的光學(xué)像差與背景干擾；如何提升弱光條件下的成像信噪比；如何高效處理大規(guī)模介觀數(shù)據(jù)等等。每一項技術(shù)瓶頸本身都是生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域的國際難題，而如何在同一系統(tǒng)上同時解決這些活體成像壁壘，則變得更為挑戰(zhàn)。
 

　　此后六年間，戴瓊海院士帶領(lǐng)成像與智能技術(shù)實驗室，瞄準(zhǔn)活體介觀顯微成像高峰，持續(xù)攻關(guān)這些國際前沿難題，先后提出掃描光場成像原理、數(shù)字自適應(yīng)光學(xué)架構(gòu)、虛擬掃描算法、共聚焦掃描光場架構(gòu)、自監(jiān)督去噪算法等關(guān)鍵理論與技術(shù)，相關(guān)成果均發(fā)表于《細(xì)胞》(Cell)、《自然》(Nature)、《自然·生物技術(shù)》(Nature Biotechnology)、《自然·方法》(Nature Methods)等國際期刊，逐一解決了介觀活體顯微成像中一系列壁壘，為新一代介觀活體顯微儀器奠定了基礎(chǔ)。
 

圖1.活體介觀成像的技術(shù)空白
 

　　9月13日，清華大學(xué)戴瓊海院士團(tuán)隊在《細(xì)胞》(Cell)發(fā)表最新工作：長時程活體介觀成像完整記錄哺乳動物器官尺度的三維細(xì)胞交互行為(Long-term mesoscale imaging of 3D intercellular dynamics across a mammalian organ)，宣布了新一代介觀活體顯微儀器RUSH3D系統(tǒng)的問世，在兼具厘米級三維視場與亞細(xì)胞分辨率的同時，RUSH3D能以20Hz的高速三維成像速度實現(xiàn)長達(dá)數(shù)十小時的連續(xù)低光毒性觀測。相比當(dāng)前市場上最先進(jìn)的商業(yè)化熒光顯微鏡，其在同樣分辨率下的成像視場面積提升近百倍，三維成像速度提升數(shù)十倍，光毒性降低上百倍(有效觀測時長提升百倍)。這一前所未有的跨空間和時間的多尺度成像能力，為復(fù)雜生物過程研究提供了全新視角。區(qū)別于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡聚焦于單個細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)交互過程，RUSH3D使得研究人員可以首次以全景方式動態(tài)觀測哺乳動物器官尺度細(xì)胞精度的組織異質(zhì)性，在活體組織中原位研究大規(guī)模多樣化細(xì)胞在完整生理與病理過程中的動態(tài)交互行為。
 

　　交叉研究團(tuán)隊利用RUSH3D在腦科學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)與藥學(xué)等多學(xué)科展示了令人矚目的成果。首次在活體小鼠上以單細(xì)胞分辨率實現(xiàn)了覆蓋大腦皮層2/3層的高速長時程三維觀測，捕捉了多感官刺激下皮層各腦區(qū)的各異性響應(yīng)模式，能夠連續(xù)多天以單神經(jīng)元精度追蹤大規(guī)模神經(jīng)響應(yīng)。首次觀測到了急性腦損傷后多腦區(qū)的免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞從非血管區(qū)域往腦內(nèi)的遷移與回流過程。首次在小鼠免疫反應(yīng)過程中同時觀測到了淋巴結(jié)內(nèi)多個生發(fā)中心的形成過程，以及T細(xì)胞在不同生發(fā)中心之間的遷移現(xiàn)象。這些初步實驗雖然僅僅展現(xiàn)了RUSH3D應(yīng)用的冰山一角，但充分展示了其為神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域前沿研究所帶來的廣闊應(yīng)用前景。該儀器的研制與產(chǎn)業(yè)化填補(bǔ)了對復(fù)雜生命現(xiàn)象介觀尺度活體觀測的空白，標(biāo)志著我國在活體介觀顯微成像領(lǐng)域持續(xù)引領(lǐng)國際發(fā)展，極大提升了我國高端科研儀器的研究和應(yīng)用水平，更為人類探索生命奧秘打開了新的維度，為揭示神經(jīng)、腫瘤、免疫新現(xiàn)象和新機(jī)理提供了新的殺手锏，使得我國生命科學(xué)家、醫(yī)學(xué)家能夠率先使用我國自主高端儀器設(shè)備來解決重大基礎(chǔ)研究問題。
 

圖2.RUSH3D系統(tǒng)圖
 

　　計算成像是改變了傳統(tǒng)光學(xué)成像“所見即所得”的設(shè)計理念。利用計算編碼、計算采集等多維尺度計算架構(gòu)，實現(xiàn)對高維光場的超精細(xì)感知與融合，為機(jī)器設(shè)計更好的感知系統(tǒng)，從而突破傳統(tǒng)光學(xué)成像的一系列物理瓶頸。然而這條創(chuàng)新之路同樣充滿荊棘，RUSH3D系統(tǒng)集成了團(tuán)隊過去十多年來一系列的理論和關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新，才真正實現(xiàn)了整體性能的顛覆性提升。針對二維傳感器難以捕捉三維動態(tài)變化的難題，團(tuán)隊提出了掃描光場成像原理，能夠在實現(xiàn)軸向400微米范圍的高速三維成像的同時，將激光照射對細(xì)胞的損傷降低了數(shù)百倍。針對活體組織復(fù)雜環(huán)境引起的光學(xué)像差降低系統(tǒng)成像分辨率與信噪比這一難題，團(tuán)隊提出了基于波動光學(xué)的數(shù)字自適應(yīng)光學(xué)架構(gòu)，無需在光學(xué)系統(tǒng)中增加額外波前傳感器或者空間調(diào)制器，在后端即可完成大視場多區(qū)域自適應(yīng)光學(xué)像差矯正，從而提升大視場復(fù)雜環(huán)境三維成像的空間分辨率以及信噪比。這一設(shè)計使得僅需常規(guī)尺寸物鏡，就能有效克服空間非一致的系統(tǒng)像差和樣本像差難題，實現(xiàn)了全視場內(nèi)均一高空間分辨率的十億像素成像，顯著降低介觀成像系統(tǒng)尺寸與成本，使得高分辨活體介觀顯微成像系統(tǒng)變得更加廣泛可及。除此之外，活體熒光成像中背景熒光嚴(yán)重影響了成像信背比，RUSH3D采用多尺度去背景算法實現(xiàn)背景信號和在焦信號的分離，精準(zhǔn)濾除散焦背景，從而提升成像信背比，恢復(fù)淹沒在熒光背景中的熒光信號。進(jìn)一步與共聚焦掃描光場融合，將能在具備高通量介觀觀測能力的同時，實現(xiàn)共聚焦成像保真度。
 

圖3.RUSH3D實現(xiàn)大視場與高分辨率兼?zhèn)涞慕橛^三維成像
 

　　RUSH3D通過其跨時空的多尺度成像能力，極大拓寬了科學(xué)家對大腦的認(rèn)知。大腦皮層的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)被認(rèn)為是高等動物神經(jīng)系統(tǒng)中十分重要而又復(fù)雜的信息處理中心，是產(chǎn)生生物智能乃至意識的關(guān)鍵神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)區(qū)域。然而，由于觀測技術(shù)限制，目前大部分研究只能同時記錄實驗動物中一個或幾個皮層區(qū)域的神經(jīng)元活動，難以進(jìn)一步研究皮層神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)合動態(tài)變化。通過RUSH3D大視場、三維高分辨率、高幀率的成像優(yōu)勢，交叉團(tuán)隊開創(chuàng)性實現(xiàn)了對頭固定下清醒小鼠背側(cè)皮層17個腦區(qū)中十萬量級大規(guī)模神經(jīng)元的長時間高速三維記錄，并且能夠?qū)ν蝗荷窠?jīng)元進(jìn)行跨天連續(xù)的追蹤。運(yùn)用該系統(tǒng)，證實了響應(yīng)感覺刺激，調(diào)控運(yùn)動的神經(jīng)元并非只存在于單一感覺皮層、運(yùn)動皮層，而是廣泛存在于皮層各個區(qū)域，但各個區(qū)域神經(jīng)元對感覺信息編碼、整合、區(qū)分的能力存在差異。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)自發(fā)運(yùn)動行為發(fā)起時，小鼠皮層神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)由尾側(cè)向鼻側(cè)傳導(dǎo)的發(fā)放模式。這一結(jié)果提示視覺、觸覺等感覺皮層神經(jīng)元的信息整合和全皮層范圍信號擴(kuò)散可能是引起自發(fā)運(yùn)動的關(guān)鍵因素。在此基礎(chǔ)上，RUSH3D有望首次實現(xiàn)解析全背側(cè)皮層的介觀腦功能圖譜，通過捕捉大腦內(nèi)的成百上千萬神經(jīng)元間的動態(tài)連接與功能，有望能揭示意識的生物學(xué)基礎(chǔ)，智能的本質(zhì)等人類基本問題，推動對神經(jīng)退行性疾病的研究，并有望推動腦啟發(fā)的人工智能發(fā)展。
 

圖4.小鼠全腦皮層范圍三維神經(jīng)成像
 

　　RUSH3D系統(tǒng)為研究大規(guī)模細(xì)胞交互提供了前所未有的工具。例如，生發(fā)中心(Germinal center, GC)是被抗原激活后的B細(xì)胞在趨化作用引導(dǎo)下聚集形成的組織結(jié)構(gòu)，對于自身免疫性疾病、疫苗、病毒感染等過程都至關(guān)重要。由于受到視場和拍攝時長的限制，免疫細(xì)胞如何參與多個GC生成以及如何在多個GC間進(jìn)行遷移的過程從來沒有被連續(xù)記錄過，從而限制了該領(lǐng)域的發(fā)展。團(tuán)隊利用RUSH3D對小鼠腹股溝附近淋巴結(jié)在免疫反應(yīng)85個小時左右進(jìn)行了長達(dá)十?dāng)?shù)小時的高速三維成像，完整記錄了B細(xì)胞參與多個GC生成的過程。與此同時，觀測到在免疫反應(yīng)145個小時GC已經(jīng)完全形成之后，一些T細(xì)胞在多個GC之間完整遷移的過程，預(yù)示了T細(xì)胞可能參與了GC之間的信息交流和傳遞。這些對信使T細(xì)胞在不同生發(fā)中心之間交流信息的觀測有望帶來我們對免疫過程的全新認(rèn)識。
 

圖5.B淋巴細(xì)胞參與小鼠淋巴結(jié)多個生發(fā)中心形成的完整過程
 

　　跨時空的多尺度成像能力使得RUSH3D極大提升了實驗效率。例如，藥物篩選實驗?zāi)軌蛟趩未螌嶒炛酗@著提高效率，免去多次試驗需求。同時，由于RUSH3D可以提供足夠數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，跨個體差異可以在一次實驗中得到有效緩解。此外，諸如腫瘤轉(zhuǎn)移等稀有事件，在RUSH3D的觀察中將不再是偶發(fā)事件，而是常規(guī)可見現(xiàn)象，成百上千倍地提升了活體生物發(fā)現(xiàn)的效率。憑借其低光毒性三維觀測的優(yōu)勢，該系統(tǒng)還能夠同時觀察到細(xì)胞間的長距離通信，并通過長時間追蹤數(shù)百萬個細(xì)胞，揭示集體細(xì)胞行為的物理規(guī)律和功能涌現(xiàn)的機(jī)制，例如能夠捕捉從腫瘤發(fā)生開始到免疫應(yīng)答、腫瘤生長的全過程，揭示腫瘤產(chǎn)生的完整免疫活化反應(yīng)。作為RUSH3D在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的初探，研究人員首次觀測到了急性腦損傷(腦震蕩等)后整個大腦皮層范圍內(nèi)的中性粒細(xì)胞遷移活動。當(dāng)小鼠的腦部受到撞擊以后，大量的中心粒細(xì)胞從血管周邊非血管區(qū)域流出進(jìn)入腦實質(zhì)，也有極罕見的細(xì)胞從腦實質(zhì)回流到血管里，這意味著有些細(xì)胞可能通過類淋巴系統(tǒng)進(jìn)入腦實質(zhì)，并且會流回血管中將信息傳遞到生物體的其他地方。通過國際首次捕捉對腦損傷修復(fù)過程單細(xì)胞水平的免疫反應(yīng)，有助于開發(fā)特定療法避免急性腦損傷后組織水腫帶來的腦功能缺失難題，并為更廣泛的腦疾病等醫(yī)學(xué)問題提供新視角。
 

圖6.急性腦損傷后全皮層范圍單細(xì)胞水平免疫反應(yīng)
 

　　基于該系列成果的核心專利已于清華大學(xué)轉(zhuǎn)化成立了國產(chǎn)自主先進(jìn)顯微儀器公司，致力于國產(chǎn)自主可控具備國際領(lǐng)先性能的高端光學(xué)顯微鏡以及其在生命科學(xué)等領(lǐng)域的前沿應(yīng)用。已支撐清華、北大、北航、北師大、解放軍總醫(yī)院、同濟(jì)醫(yī)院等國內(nèi)高水平科研機(jī)構(gòu)，在腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、腦科學(xué)等不同領(lǐng)域開展了20余項創(chuàng)新性生命科學(xué)研究，服務(wù)于生物制藥領(lǐng)域。
 

　　清華大學(xué)自動化系博士后張元龍、深圳國際研究生院博士生王鳴瑞和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士生朱齊禹是本文共同第一作者，清華大學(xué)自動化系戴瓊海院士、吳嘉敏副教授，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院郭增才副教授為論文共同通訊作者，郭鈺鐸、劉波、李嘉敏、姚嘯、孔垂、張億、黃予超、祁海參與并作出重要貢獻(xiàn)。研究得到國家自然科學(xué)基金委、國家科技部重點研發(fā)計劃以及清華大學(xué)Brain-X項目的大力支持。