【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】生物大分子的三維結(jié)構(gòu)可以直觀地揭示其生物學(xué)功能、細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程以及探索其在疾病中發(fā)揮作用的方式。冷凍電鏡(cryo-electron microscopy,cryo-EM)單顆粒分析技術(shù)通過(guò)對(duì)生物大分子的直接成像進(jìn)行高分辨率結(jié)構(gòu)測(cè)定，已成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的重要研究手段。冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)需要對(duì)生物大分子溶液的冷凍樣品采集大量電子顯微數(shù)據(jù)，以進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)解析，因此高質(zhì)量的冷凍樣品制備在其中起著至關(guān)重要的作用。良好的制樣方法需要能夠簡(jiǎn)便地、可控地制備出接近理想狀態(tài)的生物大分子冷凍樣品。
 

　　諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者雅克·杜博切特(Jacques Dubochet)等人于1984年發(fā)明了冷凍樣品制備的濾紙夾置法(Pipet-blot-plunge)，至今仍然是冷凍電鏡樣品制備的主要手段。在這種傳統(tǒng)的制樣方法中，研究人員難以精確控制樣品冰層厚度和大分子顆粒分布，導(dǎo)致冷凍樣品的均一性和可重復(fù)性較差。越來(lái)越多的證據(jù)表明，在樣品被冷凍之前的瞬間，生物大分子會(huì)吸附在超薄的液體層的氣液界面(Air-water interface, AWI)上，導(dǎo)致生物大分子的顆粒結(jié)構(gòu)損傷、變性或產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)取向，減低了高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)分析的效率和成功性。如何獲取可重復(fù)的高質(zhì)量的生物大分子冷凍樣品仍然是冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用中的一個(gè)難題。
 

圖1. ESI-cryoPrep方法設(shè)計(jì)和儀器裝置示意圖
 

　　4月25日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王宏偉課題組和精密儀器系歐陽(yáng)證、周曉煜課題組在《自然·方法學(xué)》(Nature Methods)在線發(fā)表了題為“電噴霧輔助的冷凍電鏡樣品制備方法用以減輕界面吸附效應(yīng)”(Electrospray-assisted cryo-EM sample preparation to mitigate interfacial effects)的研究論文。研究采用非變性質(zhì)譜(Native mass spectrometry, native MS)中廣泛使用的電噴霧電離(Electrospray ionization, ESI)技術(shù)，設(shè)計(jì)并搭建了一種新型冷凍樣品制備裝置ESI-cryoPrep(圖1)，成功實(shí)現(xiàn)了無(wú)需濾紙夾吸的冷凍樣品制備，并獲得了多種生物大分子近原子分辨率的三維結(jié)構(gòu)。
 

　　研究表明，ESI-cryoPrep可以有效地將生物大分子顆粒完整嵌入無(wú)定形態(tài)薄層冰中，避免其吸附在空氣-水、固體-水界面上，并對(duì)該裝置制備生物大分子冷凍樣品過(guò)程中的界面模型進(jìn)行了機(jī)理闡釋。ESI-cryoPrep以“軟”電離技術(shù)ESI為基礎(chǔ)，通過(guò)向蛋白溶液施加高電壓形成大量帶電的蛋白液滴，可以有效地減少蛋白的變性與碎裂。在電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)下，帶電液滴飛向電鏡載網(wǎng)的過(guò)程中伴隨著去溶劑化的進(jìn)行；液滴表面的電荷密度激增至瑞利極限導(dǎo)致庫(kù)侖裂變形成帶電的次級(jí)液滴；這一過(guò)程循環(huán)往復(fù)直至液滴最終沉積在電鏡載網(wǎng)上；收集到帶電液滴的電鏡載網(wǎng)被插入液氮冷卻的液態(tài)乙烷中即可實(shí)現(xiàn)對(duì)液滴的快速冷凍。該過(guò)程完全省卻了濾紙的夾吸，避免了濾紙材料對(duì)液體和生物大分子的影響。因?yàn)橐旱伪砻娴男》肿与x子形成了雙電層效應(yīng)，生物大分子與液體的界面被隔絕開(kāi)，從而避免了生物大分子吸附到氣液或固液界面上，更好地保持了生物大分子的天然結(jié)構(gòu)。該研究首次對(duì)ESI液滴中的生物大分子的天然結(jié)構(gòu)(Native structures)進(jìn)行了直接測(cè)定，指導(dǎo)獲得ESI的“軟著陸”電離參數(shù)進(jìn)行冷凍制樣與非變性質(zhì)譜分析。該工作是冷凍電鏡與質(zhì)譜技術(shù)的交叉融合，共同致力于解答生物大分子結(jié)構(gòu)解析與分析的科學(xué)問(wèn)題。
 

　　研究團(tuán)隊(duì)在搭建的設(shè)備上，經(jīng)過(guò)多次摸索確定了制備高質(zhì)量冷凍樣品的相關(guān)參數(shù)。這些參數(shù)既能滿足保存高比例完整結(jié)構(gòu)生物大分子顆粒的需求，又能促進(jìn)帶電液滴在附著電鏡載網(wǎng)表面的擴(kuò)展和浸潤(rùn)。研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用優(yōu)化的ESI-cryoPrep裝置制備了五種生物大分子的高質(zhì)量冷凍樣品，獲得了與目標(biāo)生物大分子尺寸相對(duì)應(yīng)的理想冰層厚度，并實(shí)現(xiàn)了全部測(cè)試樣品70Sribosome、20Sproteasome、apo-ferritin、ACE2和streptavidin的高分辨率三維結(jié)構(gòu)解析，分辨率分別為2.7Å、2.0Å、2.1Å、3.3Å和1.9Å。
 

　　研究團(tuán)隊(duì)對(duì)冷凍電鏡數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入的挖掘與分析，發(fā)現(xiàn)與預(yù)期假設(shè)一致的結(jié)果。ESI-cryoPrep可以有效地將生物大分子顆粒完整嵌入無(wú)定形態(tài)冰的薄層中間，抑制目標(biāo)生物大分子在空氣-水或石墨烯-水界面的吸附(圖2)，從而避免蛋白質(zhì)顆粒的結(jié)構(gòu)損傷或者優(yōu)勢(shì)取向問(wèn)題。研究工作提出了電荷殘留模型，闡明了電噴霧電離產(chǎn)生的液滴表面的電荷不均勻分布保護(hù)蛋白質(zhì)顆粒免于界面吸附的作用和機(jī)制。這種學(xué)科交叉的研究成果不僅將為冷凍電鏡樣品制備提供應(yīng)用價(jià)值，還將對(duì)冷凍電鏡技術(shù)和非變性質(zhì)譜領(lǐng)域的交叉和發(fā)展產(chǎn)生積極影響，為更多創(chuàng)新應(yīng)用開(kāi)辟新的可能性。自主研發(fā)的高質(zhì)量冷凍電鏡樣品制備裝置，一方面可以縮短結(jié)構(gòu)解析的漫長(zhǎng)探索過(guò)程，更高效地獲得高分辨三維結(jié)構(gòu)，分析其作用機(jī)理；另一方面也提升了原創(chuàng)研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和高精尖技術(shù)的能力，減少對(duì)國(guó)外相關(guān)儀器和設(shè)備的依賴。
 

　　圖2.ESI-cryoPrep方法制備的冷凍樣品中蛋白質(zhì)顆粒在斷層成像中的代表性空間分布

 

　　清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2017級(jí)博士生楊梓和精密儀器系2018級(jí)博士生范菁津(已畢業(yè))為該論文共同第一作者，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授王宏偉，精密儀器系教授歐陽(yáng)證和副教授周曉煜為論文共同通訊作者。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王家副研究員和范瀟博士等為課題的啟動(dòng)和推進(jìn)作出重要貢獻(xiàn)。研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、騰訊基金會(huì)等的資助，并得到清華大學(xué)冷凍電鏡中心和計(jì)算中心的技術(shù)支持。