【儀表網(wǎng) 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)】中國材料與試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)科學(xué)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化領(lǐng)域委員會(huì)科學(xué)試驗(yàn)裝置標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(CSTM/FC98/TCO3)歸口承擔(dān)的《小分子有機(jī)化合物內(nèi)標(biāo)法定量分析核磁共振氫譜法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)(立項(xiàng)號(hào):CSTM LX 9803 01135——2022)已完成征求意見稿，按照《中關(guān)村材料試驗(yàn)技術(shù)聯(lián)盟團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》的有關(guān)規(guī)定，現(xiàn)公開廣泛征求意見。
 

　　核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)波譜法是一種基于特定原子核性質(zhì)的分析方法，它通過原子核在特定外磁場中吸收與其裂分能級間能量差相對應(yīng)的射頻場能量而產(chǎn)生共振信號(hào)。核磁共振現(xiàn)象自1945年被發(fā)現(xiàn)以來，廣泛應(yīng)用于有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)、分子間的相互作用和分子動(dòng)力學(xué)研究等，近些年來逐漸應(yīng)用于定量研究。定量核磁共振(quantitative Nuclear Magnetic Resonance, qNMR)具有許多優(yōu)點(diǎn)，它是一種直接分析法，測定過程中不會(huì)破壞待測樣品結(jié)構(gòu)或組分，通用性強(qiáng)，分析時(shí)間短，其最大的優(yōu)點(diǎn)是其用于含量測定時(shí)，不需要獲取目標(biāo)化合物的自身標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。色譜法在含量測定中的優(yōu)點(diǎn)是其具有高靈敏度和高專屬性，但缺點(diǎn)是需要自身標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，獲取自身標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和資金，有時(shí)即使投入成本很多，也難以獲得，而核磁共振氫譜法正好可以克服這個(gè)缺點(diǎn)。
 

　　盡管理論上任何能產(chǎn)生核磁共振信號(hào)的原子核都能做定量研究，但由于受原子核自身特性如磁旋比、天然豐度等影響，導(dǎo)致各原子核的核磁共振譜圖的分辨率和靈敏度差異較大。而定量核磁共振對檢測譜圖分辨率及靈敏度要求較高，且氫核的靈敏度和天然豐度較高。故在實(shí)際應(yīng)用中，氫譜定量核磁共振(quantitative Proton Nuclear Magnetic Resonance, 1H qNMR)的使用較為廣泛。
 

　　核磁共振氫譜定量法有相對定量和絕對定量兩種方式。相對定量是基于待測樣品中每個(gè)組分特征峰的積分面積，檢測特定組分間的相對含量。一般應(yīng)用于測定樣品中雜質(zhì)的相對含量，或者混合物中各成分相對含量。絕對定量是采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過比較樣品的特征峰面積與內(nèi)標(biāo)峰的峰面積計(jì)算樣品的含量。絕對定量在使用時(shí)有內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法，一般而言，內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性優(yōu)于外標(biāo)法，目前國際上的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中推薦采用的也是內(nèi)標(biāo)法。
 

　　在核磁共振用于小分子有機(jī)化合物的定性研究時(shí)，有比較成熟完善的管理規(guī)范和指導(dǎo)原則，如教育部制定的《超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振方法通則 JY/T 0578-2020》等，而在用于定量研究時(shí)，其對儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)參數(shù)、待測物特性以及人員操作等要求偏高，與之相關(guān)的管理規(guī)范尤其是實(shí)際應(yīng)用方面的指導(dǎo)原則比較少，極大地限制了定量核磁共振的發(fā)展。但是目前核磁共振定量檢測和分析領(lǐng)域缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，極大的限制了定量核磁技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展。因此，為推動(dòng)核磁共振氫譜定量分析法在分析檢測、含量測定等方面的應(yīng)用，滿足該技術(shù)在科研和相關(guān)行業(yè)研發(fā)的需求，制定我國核磁共振氫譜內(nèi)標(biāo)法定量分析的操作標(biāo)準(zhǔn)勢在必行。
 

　　本文件為首次發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)適用于小分子有機(jī)化合物(分子量≤900)的絕對定量中的內(nèi)標(biāo)法而擬定的，因此，本文件適用于核磁共振氫譜的內(nèi)標(biāo)法定量分析。
 

　　實(shí)驗(yàn)采集：
 

　　1.弛豫延遲時(shí)間D1 根據(jù)待測樣品和內(nèi)標(biāo)物特征峰的縱向弛豫時(shí)間T1 來設(shè)置弛豫等待時(shí)間D1，D1 的設(shè)置應(yīng)大于 5 倍T1，當(dāng)D1 設(shè)置為 7 倍的T1 時(shí)間時(shí)，99.9%可以獲得弛豫，當(dāng)D1 設(shè)置為 5 倍的T1 時(shí)間時(shí)，99.3%可以獲得弛豫，這意味著 7 倍T1 的等待時(shí)間可以將誤差從 0.7%降低到 0.1%，這對于整個(gè)準(zhǔn)確度要求控制在 1.0%內(nèi)時(shí)非常重要。在有機(jī)化合物中，一般質(zhì)子的弛豫時(shí)間都小于 10s，只有一些小分子例外，如甲酸鈣和某些對稱性非常高的分子，需要注意的是這些化合物由于特征峰明顯，經(jīng)常被選為內(nèi)標(biāo)物，這時(shí)候?qū)嶒?yàn)時(shí)間會(huì)增長。弛豫延遲時(shí)間D1，脈寬的長度和采集時(shí)間構(gòu)成了每次采集的重復(fù)時(shí)間，只要整個(gè)的重復(fù)時(shí)間達(dá)到 70s，即可達(dá)到 99.9%的弛豫，達(dá)到所需的準(zhǔn)確性，因此，D1 設(shè)置為 63s較為適宜。
 

　　2.激發(fā)角度 采用 90°角激發(fā)。與常規(guī)氫譜采集時(shí)一般采用 30°角激發(fā)相比，90°角激發(fā)可以獲得其兩倍的信噪比(要獲同樣的信噪比，若用 30°角激發(fā)的話，掃描次數(shù)要翻 4 倍)。完全弛豫一般要求D1 等待時(shí)間是特征峰和內(nèi)標(biāo)物峰質(zhì)子中較長弛豫時(shí)間的 7 倍，而 30°角激發(fā)，D1 等待時(shí)間僅能縮短到 6 倍的特征峰和內(nèi)標(biāo)物峰質(zhì)子中較長弛豫時(shí)間。因此，90°角激發(fā)是更好的選擇。
 

　　3.采集時(shí)間 采集時(shí)間 5-8s足夠，一般采用 7s。采集時(shí)間由采樣點(diǎn)數(shù)和譜寬決定。采集時(shí)間需要足夠的長，能夠覆蓋完整的FID信號(hào)，但也并不是越長越好，若自由感應(yīng)衰減信號(hào)消失后，采集到的僅是噪音信號(hào)。
 

　　4.掃描次數(shù) 采集次數(shù)是根據(jù)所選擇的特征峰要求的信噪比來決定，信噪比需要達(dá)到 150：1 以上，而信噪比對核磁積分的準(zhǔn)確度有非常重要的影響。信噪比對積分的影響用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來估算(公式RSD=86/SN)，若信噪比為 86，那么對積分帶來的不確定度為 1%。信噪比與采集次數(shù)的平方根成正比，這意味著若要得到翻倍的信噪比，需要 4 倍的采集時(shí)間來獲得。
 

　　5.發(fā)射中心 發(fā)射中心應(yīng)設(shè)置在待測物的特征峰和內(nèi)標(biāo)物的特征峰的中間，避免由于未能均勻激發(fā)造成的偏差。
 

　　處理和處理參數(shù)：
 

　　1.零填充 零填充可以增加積分的準(zhǔn)確性，將處理參數(shù)中的 SI 設(shè)置為采集參數(shù)中的 TD 若干倍數(shù)即可，如設(shè)置 SI=2*TD 可以滿足要求。
 

　　2.窗函數(shù) 如果由于樣品量不夠或者采集時(shí)間過長造成信噪比過低，可以通過添加窗函數(shù) LB(0.2~1 Hz)來提高信噪比，如將氫譜的窗函數(shù) LB 設(shè)置為 0.3。值得注意的是，添加窗函數(shù)會(huì)導(dǎo)致圖譜的分辨率降低。
 

　　3.相位調(diào)整 相位調(diào)整可以采用自動(dòng)相位調(diào)整，若自動(dòng)相位調(diào)整未達(dá)到預(yù)期目的，可以采用手動(dòng)相位調(diào)整。
 

　　4.基線校正 基線校正可以采用自動(dòng)基線校正，若自動(dòng)基線校正未達(dá)到預(yù)期目的，可以采用手動(dòng)校正。
 

　　5.積分 為保證 99%的峰面積的準(zhǔn)確積分，積分區(qū)域應(yīng)至少保證為半峰寬的 20 倍，如果這個(gè)區(qū)域范圍出現(xiàn)峰的重疊，可以適當(dāng)縮窄這個(gè)范圍，但是必須同時(shí)對目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)物的特征峰范圍進(jìn)行縮窄。
 

　　此外，如果 13C 的衛(wèi)星峰出現(xiàn)，對目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)物的特征峰進(jìn)行積分時(shí)，要么同時(shí)包含衛(wèi)星峰，要么同時(shí)都不含衛(wèi)星峰。若峰重疊無法用改變?nèi)軇┗蛘咂渌侄螌?shí)現(xiàn)，這時(shí)可以采用峰去卷積的辦法。
 

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