【儀表網(wǎng) 儀表標(biāo)準(zhǔn)】由浙江省質(zhì)量協(xié)會(huì)組織，嘉興同濟(jì)環(huán)境研究院主起草的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《水體中微囊藻基因的測(cè)定 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法》已完成征求意見稿，根據(jù)《團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理規(guī)定》(國(guó)標(biāo)委聯(lián)〔2019〕1 號(hào))、《浙江省質(zhì)量協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理辦法》(試行)的有關(guān)規(guī)定，現(xiàn)公開征求意見。
 

　　近年，水體富營(yíng)養(yǎng)化已成為一個(gè)全球關(guān)注的環(huán)境問題，在富營(yíng)養(yǎng)化水體中存在高濃度的營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)，如氮、磷等，可促使藻類大量生長(zhǎng)形成水華。早在19世紀(jì)末，就有動(dòng)物飲用含有藍(lán)藻污染物的水而出現(xiàn)死亡的相關(guān)報(bào)道。因此，湖泊富營(yíng)養(yǎng)化和藍(lán)藻水華是同前全世界共同面臨的重大環(huán)境問題之一。
 

　　在水華期間，會(huì)使湖泊生物多樣性下降，而且產(chǎn)毒藍(lán)藻會(huì)釋放大量生物毒素，其中藍(lán)藻產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物—微囊藻毒素(Microcystin, MC)危害程度較強(qiáng)，它是一種在藍(lán)藻水華污染中產(chǎn)生量最大、出現(xiàn)頻率最高和造成危害最嚴(yán)重的藻毒素種類之一。這些毒素可在魚、蝦、蟹等水生動(dòng)物富集，經(jīng)食物鏈可影響人類健康，既能影響漁業(yè)養(yǎng)殖，也可造成飲用水安全等問題。產(chǎn)生微囊藻毒素的藻類主要有藍(lán)藻門微囊藻屬、魚腥藻屬、顫藻屬，藍(lán)藻毒素通過其危害方式可分為肝毒素和神經(jīng)毒素，它們是肝癌的強(qiáng)烈促癌劑，另一類毒素對(duì)皮膚有刺激作用。當(dāng)藍(lán)藻細(xì)胞破裂或死亡時(shí)，毒素就會(huì)被釋放到水中，常規(guī)的水處理工藝不能有效的將它去除。
 

　　許多水體爆發(fā)的“水華”是由藍(lán)藻的瘋狂生長(zhǎng)引起的，而在水華藍(lán)藻中又以微囊藻為優(yōu)勢(shì)種，常見的微囊藻中既有產(chǎn)毒株也有不產(chǎn)毒株，常規(guī)的藍(lán)藻監(jiān)測(cè)以顯微鏡下形態(tài)觀察、計(jì)數(shù)為主，方法粗略，易漏檢或誤檢。并且產(chǎn)毒株和不產(chǎn)毒株在顯微鏡下的形態(tài)是一樣的，肉眼無法分辨，因此常規(guī)顯微鏡鏡檢法準(zhǔn)確度不高，有待于發(fā)展既快又準(zhǔn)確的產(chǎn)毒微囊藻的檢測(cè)方法。
 

　　本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。參考GB/T 14581 水質(zhì) 湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)；HJ/T 91 地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范；HJ 494 水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)等規(guī)程內(nèi)容編制。
 

　　方法原理：
 

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是指在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
 

　　本方法運(yùn)用TaqMan探針法，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，使系統(tǒng)中的熒光強(qiáng)度或者熒光種類發(fā)生變化，通過檢測(cè)這種變化可測(cè)出PCR反應(yīng)體系中產(chǎn)物的種類和量。
 

　　儀器與設(shè)備：
 

　　1.采水器：不銹鋼或有機(jī)玻璃材質(zhì)，圓柱形。容量和深度規(guī)格要滿足采樣要求。
 

　　2.微量砂芯過濾器：250 mL，包括漏斗(直徑25 mm，容積200 mL)、多孔聚酯濾膜支撐板、收集瓶。
 

　　3.真空泵：相對(duì)真空度不高于-17 kPa。
 

　　4.微量冷凍高速離心機(jī)：1.5 mL轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速不低于14000 rpm。
 

　　5.離心機(jī)：2 mL，轉(zhuǎn)速不低于6000 rpm。
 

　　6.振蕩混勻器。
 

　　7.熒光定量PCR儀：溫度范圍4.0 ℃～99.9 ℃。
 

　　8.PCR反應(yīng)管：根據(jù)qPCR儀要求選擇單管、八聯(lián)排管或96孔熒光反應(yīng)板。
 

　　9.烘箱：60 ℃ ± 2 ℃。
 

　　10.水浴裝置：加熱溫度可調(diào)，可精確調(diào)至植物DNA提取試劑盒說明書要求的溫度。
 

　　11.微量移液器：2 μL、10 μL、50 μL、200 μL和1000 μL
 

　　12.移液槍或移液管：10 mL。
 

　　13.酒精噴壺：100 mL～250 mL。
 

　　14.不銹鋼鑷子。
 

　　15.冰箱：規(guī)格為4 ℃和-20 ℃。
 

　　16.冷藏箱。
 

　　17.二級(jí)生物安全柜。
 

　　18.計(jì)時(shí)器。
 

　　19.高壓滅菌器。
 

　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定水體中總微囊藻基因和產(chǎn)毒微囊藻基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于飲用水、地表水中總微囊藻基因和產(chǎn)毒微囊藻基因的測(cè)定。
 

　　本標(biāo)準(zhǔn)樣品當(dāng)水樣提取體積為30mL時(shí)，總微囊藻基因檢出限為50copies/mL，測(cè)定下限為200copies/mL；產(chǎn)毒微囊藻基因的檢出限為38copies/mL，測(cè)定下限為15copies/mL。(更多詳情請(qǐng)見附件)