(貨號(hào):WLE5003)
原理概述:
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù):在常溫恒溫下,重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA,在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下,侵入雙鏈DNA模板;在侵入位點(diǎn)形成D-loop區(qū)域,并開(kāi)始對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行掃描;待找到與引物互補(bǔ)的目的區(qū)域后,復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時(shí),聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端,開(kāi)始鏈的延伸。本試劑盒在39 oC下,依賴(lài)核酸外切酶的作用,加入根據(jù)模版設(shè)計(jì)的特異的分子探針,使用熒光監(jiān)測(cè)設(shè)備能實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)片段擴(kuò)增過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。
引物設(shè)計(jì):
建議使用長(zhǎng)度在30-35 bp的引物,引物過(guò)短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度;引物設(shè)計(jì)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增;擴(kuò)增子長(zhǎng)度建議在150-300 bp,通常不超過(guò)500 bp。
熒光探針設(shè)計(jì):
探針序列不與特異性引物識(shí)別位點(diǎn)重疊,長(zhǎng)度為46-52 nt,序列避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。探針共有四個(gè)修飾位點(diǎn):距離5’端的≥35 nt的中部位置標(biāo)記一個(gè)dSpacer(四氫呋喃,THF),作為核酸外切酶的識(shí)別位點(diǎn);THF位點(diǎn)的上游標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán),下游標(biāo)記一個(gè)粹滅基團(tuán),兩個(gè)基團(tuán)的間距為2-4 nt;THF距離3’末端≥15 nt,并且3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán),例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-Spacer。
試劑盒組成:
100T/盒
組成 | 含量 |
C buffer | 1 mL×2管 |
L buffer | 500 μL×1管 |
P-core | 1.2 mL×1管 |
E-core | 60 μL×1管 |
B buffer | 300 μL×1管 |
使用說(shuō)明書(shū) | 1份 |
試劑盒儲(chǔ)存:
運(yùn)輸條件:低溫運(yùn)輸;
儲(chǔ)存條件:儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 oC,避光保存,避免重壓、反復(fù)凍融;
操作步驟:提前將試劑盒所需組分取出,冰上或低溫下融化(C buffer可室溫融化),震蕩混勻。
1) 向無(wú)菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer;
2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針,再加入1.5μL dNTPs(10 mM);
3) 向反應(yīng)管中加入12 μL P-core和0.6 μL E-core,(步驟1~3可以混合后再分裝至反應(yīng)管中);
4) 向反應(yīng)管中加入3.8 μL核酸模板;
5) 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合(加入B buffer反應(yīng)立即被啟動(dòng));混勻后,將反應(yīng)液甩(或快速離心)至管子底部,然后立即將反應(yīng)管放入熒光檢測(cè)設(shè)備中。熒光檢測(cè)程序設(shè)置為:恒溫39 oC;每30 s采集一次熒光信號(hào);反應(yīng)時(shí)間20 mins。
注:如使用ABI系列PCR儀,請(qǐng)務(wù)必于passive reference和quencher處均選擇“none”。
體系配制
組分 | 體積(μL) |
C buffer | 20
5 |
L buffer | |
P-core | 12 |
E-core | 0.6 |
dNTPs(10 mM) | 1.5 |
下游引物(10 μM) | 2 |
下游引物(10 μM) | 2 |
探針(10 μM) | 0.6 |
DNA模板 | 3.8 |
B buffer | 2.5 |
總體積 | 50 |
N:陰性對(duì)照; P:正對(duì)照 |
注意事項(xiàng):
- 為保證液體試劑組分活性,請(qǐng)保證儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 oC;試劑使用時(shí)請(qǐng)保持低溫,避免高溫放置過(guò)長(zhǎng)時(shí)間;
- 在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免微量核酸染,并設(shè)置空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)組。