亞硫酸鹽還原菌的生物學(xué)特性及檢驗(yàn)方法！

亞硫酸鹽還原菌的生物學(xué)特性及檢驗(yàn)方法！

一、生物學(xué)特性與衛(wèi)生學(xué)意義

亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌是梭狀芽胞桿菌屬的一群細(xì)菌，而不是一個(gè)生物學(xué)分類單位。多指厭氧芽胞桿菌，代表性菌株是致黑梭狀芽胞桿菌，其他常見的還有產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌等。此類細(xì)菌的主要特征是將亞硫酸鹽還原為硫化物，多為有動(dòng)力的革蘭氏陽性菌，可形成芽胞，厭氧生長(zhǎng)。

厭氧亞硫酸鹽還原菌的孢子在自然環(huán)境中廣泛存在，通常出現(xiàn)在人和動(dòng)物的糞便排泄物，廢水和土壤中。與大腸桿菌和其它桿菌不同的是，由于它們的孢子比營(yíng)養(yǎng)體對(duì)物理和化學(xué)因子具有更強(qiáng)的抵抗力，所以可以在自然環(huán)境中存活很大時(shí)間。因而，通常將他們作為*污染或間斷污染的指示菌。它們甚至可以抵抗正常水處理所用氯的工作濃度，因此，它們對(duì)判斷是否已達(dá)到控制目的非常有用。

由于此類細(xì)菌抵抗力強(qiáng)，即使在經(jīng)適當(dāng)加工處理的加工食品中其芽胞仍會(huì)存活，條件適宜時(shí)又會(huì)生長(zhǎng)繁殖，造成食品品質(zhì)降低，甚至?xí)鹗澄镏卸镜奈ｋU(xiǎn)。因此在食品的制備、貯存以及食品加工廠環(huán)境衛(wèi)生控制上頗受重視，作為食品、礦泉水、加工設(shè)備衛(wèi)生、生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生狀況的評(píng)估指標(biāo)，正確得到越來越廣泛的應(yīng)用。

該類細(xì)菌的檢測(cè)多用于環(huán)境水質(zhì)和生活飲用水污染狀況的評(píng)估，在九十年代中后期開始在食品衛(wèi)生領(lǐng)域中有所要求，但多局限于歐洲國家和地區(qū)，如法國、瑞士、英國、捷克等歐盟成員國。到目前為止，該菌一般不被作為食品衛(wèi)生常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目和致病菌檢測(cè)內(nèi)容，我國和美國未將該檢測(cè)項(xiàng)目列入食品微生物檢測(cè)項(xiàng)目和要求中。

二、檢測(cè)方法

由于此類細(xì)菌以形成芽胞、厭氧生長(zhǎng)和還原亞硫酸鹽為硫化氫為主要特征，往往無需作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，因此在檢測(cè)中將滿足以上三個(gè)條件的一群細(xì)菌全部認(rèn)定為厭氧亞硫酸鹽還原菌。

檢測(cè)方法一般包括以下三部分：檢樣在接種前在80-100℃水浴中處理10-15分鐘，以殺滅抵抗力弱的芽胞細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)體，同時(shí)刺激芽胞的繁殖；通過選擇性培養(yǎng)如亞硫酸鐵鹽瓊脂等判定是否具有還原亞硫酸鹽的能力，如果有則進(jìn)一步與培養(yǎng)基中的亞鐵鹽如枸櫞酸鐵反應(yīng)，使菌落呈現(xiàn)黑色；培養(yǎng)基接種后置于厭氧環(huán)境中培養(yǎng)確認(rèn)厭氧特征。也可在培養(yǎng)基中加入抗生素等抑制劑抑制其它非亞硫酸鹽還原菌的生長(zhǎng)。

下面詳細(xì)介紹亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌的檢驗(yàn)方法。

1.培養(yǎng)基和試劑

1.1 胰蛋白胨稀釋液

1.2 亞硫酸鐵瓊脂

1.3 過氧化氫試劑

2.儀器和設(shè)備

2.1 均質(zhì)器:用于處理固體樣品

2.2培養(yǎng)罐（箱）,帶產(chǎn)生厭氧環(huán)境的設(shè)備或試劑

2.3 恒溫培養(yǎng)箱:37±1℃或46±1℃

2.4 振蕩器

2.5 吸管:1mL、10mL,具0.1mL刻度

2.6 培養(yǎng)皿:直徑為90mm

2.7 稀釋瓶:容量為500mL和250mL的廣口瓶

2.8 天平:感量0.1g

3.抽樣和試樣制備

3.1 抽樣

參照SN0330-94規(guī)定抽樣

3.2試樣制備

無菌操作稱取剪碎后的樣品25g,置于裝有225mL胰蛋白胨稀釋液的廣口瓶中。若檢測(cè)亞硫酸鹽還原梭菌的芽胞,可75℃ 20min或煮沸保持10min熱處理樣品,之后以流水迅速冷卻至室溫后再稱取。充分混勻后據(jù)樣品污染情況做進(jìn)一步的系列十倍梯度稀釋。

4.檢驗(yàn)步驟與計(jì)數(shù)

4.1菌落計(jì)數(shù)法

適用于檢查未經(jīng)加工處理的生鮮食品及亞硫酸鹽還原梭菌計(jì)數(shù)>10g(mL)的食品。

4.1.1接種和培養(yǎng)

4.1.1.1對(duì)每一份試樣，選用適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣液，分別用滅菌吸管吸取1 mL，一式雙份地接種于每個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿中。

4.1.1.2 傾注約15 mL制備好的并于水浴箱保溫至45℃的亞硫酸鐵瓊脂。從制備初稀釋液結(jié)束到傾注培養(yǎng)基于后一個(gè)平皿所用的時(shí)間不應(yīng)超過15min。仔細(xì)將接種物和培養(yǎng)基充分混勻，水平放置，使其凝固。

4.1.1.3待混合物凝固后，在傾注10 mL同樣的培養(yǎng)基于已凝固的培養(yǎng)基上作為隔層以防氧吸附，并防止細(xì)菌蔓延生長(zhǎng)。

4.1.1.4 待該隔層凝固后反轉(zhuǎn)制備好的平板，于37±1℃厭氧培養(yǎng)24-48h。若對(duì)培養(yǎng)溫度有特殊要求（如46℃），可依據(jù)情況進(jìn)行培養(yǎng)。

4.1.2計(jì)數(shù)

4.1.2.1亞硫酸鹽還原梭菌在亞硫酸鐵瓊脂上呈暗灰色或黑色菌落。37±1℃厭氧培養(yǎng)24h后，計(jì)數(shù)典型的菌落；若平板上無特征性菌落或菌落較?。?lt;0.5mm），則需繼續(xù)培養(yǎng)24h再計(jì)數(shù)；若48 h后的菌落增大以至相連，則以24 h的計(jì)數(shù)為準(zhǔn)，反之則以48h為準(zhǔn)。

那些僅產(chǎn)生氫（而不是H2S）的厭氧菌生長(zhǎng)時(shí)也可還原亞硫酸鹽而導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)彌散的、非典型的普遍變黑，這種現(xiàn)象不應(yīng)計(jì)數(shù)。

4.1.2.2取特征性菌落（不少于5個(gè)）移種于皰肉培養(yǎng)基中，37±1℃厭氧培養(yǎng)24-72 h。待出現(xiàn)生長(zhǎng)特征（培養(yǎng)液渾濁、產(chǎn)氣、出現(xiàn)異味）后，按5條進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)。對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行計(jì)數(shù)。

4.1.2.3讀取帶有10-100個(gè)黑色菌落的平皿，結(jié)果以相應(yīng)稀釋度的兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)來計(jì)算每克樣品中亞硫酸鹽還原梭菌數(shù)。結(jié)果報(bào)告如下：估計(jì)亞硫酸鹽還原梭菌數(shù)/g(mL)。

若相應(yīng)測(cè)試試樣的兩個(gè)平板上均無特征性菌落，以<10/g(mL)報(bào)告

4.2近似值（MPN）法

適用于檢查亞硫酸鹽還原梭菌計(jì)數(shù)≤10 g(mL)及含有受損傷的亞硫酸鹽還原梭菌的加工食品。

4.2.1接種和培養(yǎng)

4.2.1.1增菌

選用適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋的樣液，從每個(gè)樣液中分別吸取1mL，一式三份地接種于3管裝有皰肉培養(yǎng)基的試管中,接種后上面覆蓋一層無菌的液體石蠟，37±1℃培養(yǎng)24-72h。待出現(xiàn)生長(zhǎng)特征（培養(yǎng)液混濁、產(chǎn)氣、出現(xiàn)異味）后,按5.1條進(jìn)行鏡檢。反之，則報(bào)告陰性。

4.2.1.2分離培養(yǎng)

取4.2.1.1增菌培養(yǎng)物1mL置于滅菌的培養(yǎng)皿中，傾注約15mL45℃的亞硫酸鐵瓊脂。仔細(xì)將接種物和培養(yǎng)基充分混勻，待其凝固后，再傾注10mL同樣的培養(yǎng)基作為隔層，于37±1℃厭氧培養(yǎng)24-48h。生成的暗灰色或黑色菌落，按5條加以證實(shí)；反之，則報(bào)告陰性。

4.2.2結(jié)果計(jì)算

4.2.2.1計(jì)數(shù)每個(gè)稀釋度得到的陽性反應(yīng)管數(shù)。

4.2.2.2利用MPN表，由陽性管數(shù)估算每克（毫升）試樣中亞硫酸鹽還原梭菌近似值。結(jié)果報(bào)告如下：估計(jì)亞硫酸鹽還原梭菌數(shù)/g(mL)。

5.證實(shí)試驗(yàn)

5.1形態(tài)觀察

取皰肉培養(yǎng)物涂片，鏡檢，作革蘭氏染色，檢查培養(yǎng)物細(xì)菌形態(tài)。亞硫酸鹽還原梭菌為革蘭氏陽性桿菌，單個(gè)散在，成對(duì)、成小鏈狀或并列地聚堆存在。產(chǎn)芽胞時(shí)，芽胞呈卵圓形或球形，位于*、次終端或終端。

5.2過氧化氫酶試驗(yàn)

在潔凈載玻片上滴1滴培養(yǎng)物，再滴加1-2 滴3% 的過氧化氫。

出現(xiàn)小氣泡說明有過氧化氫酶活性。

亞硫酸鹽還原梭菌不形成過氧化氫酶。

附錄：

A1 胰蛋白胨稀釋液

將8.5g和1.0g胰蛋白胨溶解于1000 mL蒸餾水中。調(diào)節(jié)pH至7.2±0.1。分裝225 mL于250 mL廣口瓶中，121℃高壓滅菌15min。

A2 亞硫酸鐵瓊脂

胰蛋白胨 15.0g

大豆蛋白胨 5.0g

酵母浸膏 5.0g

偏重亞硫酸鈉 1.0g

檸檬酸鐵銨 1.0g

瓊脂 20.0g

蒸餾水 1000g

將各成分混勻，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.6±0.1，分裝于500 mL錐形瓶中各250 mL，121℃高壓滅菌15 min。一周內(nèi)用完。

A3皰肉培養(yǎng)基

牛肉浸液 1000 mL

蛋白胨 30.0g

酵母浸膏 5.0g

* 5.0g

葡萄糖 3.0g

可溶性淀粉 2.0g

碎肉渣 適量

取碎肉渣分裝15mm×150mm試管約2-3cm高，將上述液體培養(yǎng)基分裝至每管內(nèi)超過肉渣表面約1 cm。121℃高壓滅菌15 min。

A4 過氧化氫酶試驗(yàn)

挑取培養(yǎng)物一接種環(huán)，置于潔凈載玻片上，滴加3%*（臨用時(shí)配制）2mL，于半分鐘內(nèi)觀察發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。

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