熒光假單胞菌的檢測方法有哪些？

熒光假單胞菌的檢測方法有哪些？

熒光假單胞菌（P.Fluorescens）是一種環(huán)境污染菌。對于人類是一種罕見的機(jī)會致病菌。熒光假單胞菌屬于假單胞菌屬，是化能異養(yǎng)型的革蘭氏陰性菌，呈桿狀，有鞭毛。能分泌黃綠色熒光色素發(fā)出熒光，能產(chǎn)生抗生素、水解酶等代謝產(chǎn)物，在 4℃-37℃范圍內(nèi)，中性環(huán)境中生長，生理生化特性顯著，是作為嗜冷菌是牛奶中危害大的微生物。

熒光假單胞菌的檢測方法

目前我國對乳制品中嗜冷菌數(shù)量的檢測采用國家標(biāo)準(zhǔn)NYT 1331-2007中平板計(jì)數(shù)的方法，對熒光假單胞菌沒有專門的國標(biāo)，但是國內(nèi)外對熒光假單胞菌檢測技術(shù)有豐富的研究。

⒈平板計(jì)數(shù)法

乳品聯(lián)合會（IDF）采用 IDF Standard 101A 和 IDF Standard 132A檢測標(biāo)準(zhǔn)，前者采用 6.5℃培養(yǎng)10天后平板計(jì)數(shù)，后者 21℃培養(yǎng) 25h后計(jì)數(shù)，132A培養(yǎng)時(shí)間短穩(wěn)定性好，菌數(shù)較為準(zhǔn)確。平板計(jì)數(shù)法將原料乳稀釋后，采用涂布法，傾注法，3M細(xì)菌總數(shù)試紙等方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，傾注法由于溫度較高導(dǎo)致精確度較低，3M 試紙精確度和效率較高。平板計(jì)數(shù)法是傳統(tǒng)的檢測方法，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，但耗時(shí)太長，25h遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)快速檢測的要求。

⒉直接熒光過濾法

直接熒光法DEFT（Direct Epifluorescent Filter Technique）是利用電離輻射對食品樣品菌落計(jì)數(shù)的方法，操作簡便，具有高通量性。將樣品通過過濾器后，吖啶橙染色，在紫外顯微鏡下活細(xì)胞能觀察到橘黃色，而死細(xì)胞染成綠色，可以統(tǒng)計(jì)出樣品中所有菌落的總數(shù)。原料乳用濾膜過濾后染色，計(jì)數(shù)得熒光假單胞菌相關(guān)性系數(shù)為0.91，且在25min內(nèi)完成檢測。相對于傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)方法，DEFT 大大縮短檢測時(shí)間，利用其原理，可以實(shí)現(xiàn)對多種食品中菌落數(shù)的快速檢測。但是 DEFT 的靈敏度不高，只能用于檢測一定范圍內(nèi)菌落數(shù)，當(dāng)食品中菌數(shù)含量較少時(shí)沒有良好的線性關(guān)系，且實(shí)驗(yàn)儀器比較昂貴，在工業(yè)生產(chǎn)中不能很好的適用。

⒊流式細(xì)胞法

流式細(xì)胞法FCM（Flow Cytometry Method）可以檢測菌液中標(biāo)記熒光信號的單細(xì)胞，對菌株實(shí)現(xiàn)逐一定量分析。流式細(xì)胞法檢出的菌數(shù)是平板計(jì)數(shù)法的 3.8 倍，因?yàn)槟芙y(tǒng)計(jì)到總體菌落數(shù)量。利用這個(gè)方法檢測牛奶中假單胞菌，能在4 h內(nèi)完成檢測，且在菌落數(shù)含量較少時(shí)靈敏度有很大的提高。此方法可以快速準(zhǔn)確的檢測原料乳中熒光假單胞菌含量，但流式細(xì)胞法操作過程較為復(fù)雜，且容易被多種因素影響檢測到的結(jié)果。

⒋PCR 法

針對16S rRNA 保守序列設(shè)計(jì)引物，通過 PCR 擴(kuò)增，可以將牛奶中嗜冷菌擴(kuò)增出147bp的 DN段，標(biāo)記后用 ELISA 檢測，得到熒光假單胞菌AH-70 的OD450和菌濃度的方程，分析得此方法和平板計(jì)數(shù)法的相關(guān)系數(shù)達(dá)到 0.94，可以檢測菌濃度范圍是103-107CFU/mL。PCR 檢測具有很高的靈敏度，特異性較強(qiáng)，有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)原料奶中埃希腸桿菌的濃度達(dá)到 10CFU/mL 時(shí)能被檢測出來。PCR 檢測菌落數(shù)結(jié)果同樣會受到死菌株數(shù)的影響，而且在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中對食品提取可以PCR擴(kuò)增的DNA難度很大，容易被食品體系中因素影響精確度。

⒌氨肽酶法

氨肽酶法通過革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的氨肽酶與特定的化合物反應(yīng)，檢測氨肽酶的活性。呂元等人用氨肽酶法，對杭州地區(qū)原料奶中熒光假單胞菌，阪崎腸桿菌和魯氏不動桿菌 3 種優(yōu)勢嗜冷菌進(jìn)行快速檢測。結(jié)果得出 3 種菌的濃度和氨肽酶活性存在顯著的相關(guān)性，且與傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果沒有顯著差異，可以在很大程度上縮短檢測的時(shí)間。在檢測冷藏肉類中嗜冷菌報(bào)道，氨肽酶法的檢測范圍是104-108CFU/mL，檢測時(shí)間為2.5 h，與平板計(jì)數(shù)法結(jié)果的相關(guān)性為0.88。顯然氨肽酶法能達(dá)到快速檢測的效果，氨肽酶法適用于定性檢測，可以根據(jù)反應(yīng)顏色用肉眼觀察，但檢測靈敏度較其他方法差，大的問題是原料樣品中的革蘭氏陽性菌無法被檢出，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。

⒍ELISA 法

ELISA 法通過抗體特異性反應(yīng)檢測菌落數(shù)，具有高靈敏性，也易于同其他方法結(jié)合。PicardC 等人通過測定酪蛋白糖多肽計(jì)算原料乳中嗜冷菌含量。利用單克隆抗體，檢測出成品奶樣中嗜冷菌，與平板計(jì)數(shù)法相關(guān)性達(dá) 0.96。從脫脂奶粉中檢測6種沙門氏菌，檢出線為10 CFU/mL，檢測時(shí)間為3h。CrociL等人在對豬肉樣品的檢測中，將 ELISA 方法和 PCR 法、平板計(jì)數(shù)進(jìn)行對比，得出前面兩者都較為靈敏，低檢出線為1-10個(gè)/25g，檢測結(jié)果符合 ISO 規(guī)定。

⒎免疫磁珠法

免疫磁珠技術(shù)可以快速的富集乳制品中低濃度的菌，通過結(jié)合 PCR、ELISA等方法可以達(dá)到快速、準(zhǔn)確的檢測目的。呂琦等人通過對 4 中菌保守序列基因設(shè)計(jì)引物，建立多重 PCR 體系，在7-8h檢測時(shí)間內(nèi)，檢測靈敏度達(dá)到 102CFU/mL，具有特異性。免疫磁珠技術(shù)檢測在各個(gè)方面都表現(xiàn)出一定優(yōu)勢，改進(jìn)得到嗜冷菌的保守序列能表現(xiàn)高通量性。對于免疫磁珠技術(shù)檢測乳制品中菌濃度的研究報(bào)道較少，但是應(yīng)用于檢測有害化合物的研究都比較成熟，應(yīng)用廣泛。

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