常規(guī)培養(yǎng)基的配制原理與實驗方法！
常規(guī)培養(yǎng)基的配制原理與實驗方法！
一、目的要求
了解培養(yǎng)基的配制原理。
了解培養(yǎng)基常規(guī)配制程序。
了解培養(yǎng)基配制過程各環(huán)節(jié)的要求和注意事項。
二、基本原理
正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實驗工作的重要基礎(chǔ)，由于微生物種類及代謝類型的多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同，例如器皿的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相向。
三、實驗材科
(一)藥品
待配各種培養(yǎng)的組成成分，瓊脂，1mol/L NaOH溶液，1mol/L (升，統(tǒng)一用大寫)HCl溶液。
(二)儀器
天平或臺秤，高壓蒸汽滅菌鍋。
(三)玻璃器皿
移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。
(四)其他物品
藥匙、稱量紙、pH試紙、記號筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙、報紙等。
四、實驗內(nèi)容
(一)玻璃器皿的洗滌和包裝
1．玻璃器皿的洗滌
玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將錐形瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中，用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡。再用自來水及蒸餾水沖洗，洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。
2．滅菌前玻璃器皿的包裝
(1)培養(yǎng)皿的包裝 培養(yǎng)皿由一蓋—底組成一套。可用報紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。
(2)移液管的包裝 在移液管的上端塞入—小段棉花(勿用脫脂棉)。它的作用是避免外界及口中雜菌吹入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng)距管口約0.5cm左有。棉花自身長度約1-1．5cm。塞棉花時，可用一外圈拉直的曲別針，將少許棉花塞入管口內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜，吹時以能通氣而又不使棉花滑下為準(zhǔn)。
先將報紙裁成寬約5cm左右的長紙條，然后將已塞好棉花的移液管放在長條報紙的一端，約成45度角，折疊紙條包住，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。
(二)液體及固體培養(yǎng)基的配制過程
1．液體培養(yǎng)基配制
(1)稱量一般可用1/100粗天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品。先按培養(yǎng)基配方計算各成分的用量，然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。
(2)溶化 將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據(jù)實驗需要可用自來水或蒸餾水)，用玻棒攪動，加熱溶解。
(3)定容 待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時，可預(yù)先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養(yǎng)基中。
(4)調(diào)pH 一般用pH試紙測定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時，可用1mol/l NaOH或1mol/l HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試，直至達(dá)到所需pH為止。
(5)過濾 用濾紙或多層紗布過濾培養(yǎng)基。一般無特殊要求時，此步可省去。
2．固體培養(yǎng)基的配制
配制固體培養(yǎng)基時，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1．5％-2％)加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，后補足因蒸發(fā)而失去水分。
(三) 培養(yǎng)基的分裝
根據(jù)不同需要，可將己配好培養(yǎng)基分裝入試管或錐形瓶內(nèi)，分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。
1．試管的分裝
取一個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾住玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。
裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150 mm時，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1／4左右為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時，在瓊脂*融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1／5(約3—4m1)；半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1／3為宜。
2．錐形瓶的分裝
用于振蕩培養(yǎng)微生物用時，可在250 m1錐形瓶中加入50 ml的液體培養(yǎng)基，若用于制作平板培養(yǎng)基用時，可在250 m1錐形瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉(按2％計算)，滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化。
(四)棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎
為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或錐形瓶內(nèi)空氣預(yù)*行過濾除菌。通常方法是在試管及錐形瓶口加上棉花塞等。
1．試管棉塞的制作
制棉塞時，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的圓孔上，用右手食指將棉花從壓入團(tuán)孔中制成棉塞，然后直接壓入試管或錐形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞。
制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入。棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的2／3在試管內(nèi)，1／3在試管外(圖5—1—4)。
目前也有采用金屬或塑料試管帽代替棉塞。直接蓋在試管口上。滅菌待用。
將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或蓋好管帽的試管擁成一捆，外面包上一層牛皮紙。用鉛筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期，滅菌待用。
2．錐形瓶棉塞制作
通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上。目前也有采用無菌培養(yǎng)容器封口膜直接蓋在瓶口，既保證良好通氣，過濾除菌又操作簡便，故極受歡迎。
在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包上八層紗布或蓋好培養(yǎng)容器封口膜的錐形瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。
(五)培養(yǎng)基的滅菌
培養(yǎng)基經(jīng)分裝包扎之后，應(yīng)立即進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，100Pa滅菌20min（滅菌條件根據(jù)培養(yǎng)基不同有所差異，含糖培養(yǎng)基105℃，30min）。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)暫存于冰箱中。
(六)斜面和平板的制作
1．斜面的制作
將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒上，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面(圖5—1—5)。斜面長度不超過試管長度1／2為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時，滅菌后則應(yīng)垂直放置至冷凝。
2．平板的制作
將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷至50℃左右傾入無菌培養(yǎng)皿中。溫度過高時，皿蓋上的冷凝水太多，溫度低于50℃，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。
平板的制作應(yīng)采用無菌操作，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿錐形瓶的底部或試管，左于同時用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，月左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入10-12m1的培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋，置
于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿、使培養(yǎng)基均勻分布于整個平皿中、冷凝后即成平板。
(七)培養(yǎng)基的無菌檢查
滅菌后的培養(yǎng)基，一般需進(jìn)行無菌檢查。從中取出1-2管（瓶），置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)1—2天，確定無菌后方可使用。
(八)無菌水的制備
在每個250 mL的錐形瓶內(nèi)裝99mL的蒸餾水并塞上棉塞。在每支試管內(nèi)裝4.5m1蒸餾水。塞上棉塞或蓋上塑料試管蓋。再在棉塞上包上一張牛皮紙。高壓蒸汽滅菌，100 Pa滅菌20分鐘。
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