ssDNA/RNA環(huán)化連接酶

商品屬性：

商品介紹：

描述： ssDNA/RNA CircLigase 為熱穩(wěn)定的 DNA/RNA 連接 酶，不依賴于 ATP，可催化單鏈 DNA 或單鏈 RNA 的分子內(nèi) 環(huán)化。環(huán)化反應(yīng)中，要求催化底物單鏈 DNA/RNA 具有 5’- 磷酸基團(tuán)和 3’-OH 基團(tuán)。對(duì)于大于 15nt 的單鏈底物，該酶 都能高效的連接。 

組分

活性定義：65°C 1h 條件下，催化 1pmol 5’-磷酸化的 ssDNA
底物環(huán)化，所需的酶量定義為 1Unit。
儲(chǔ)存：-20℃可保存 3 年。
反應(yīng)實(shí)例
1. 按以下組分配制反應(yīng)液
CircLigase (100 U/μl) 1 μl
5’磷酸化 ssDNA/RNA 10-100 pmol
10×CircLigase Buffer 2 μl
50mM MnCl2 1 μl
ddH2O Up to 20 ul
65°C 孵育 1h 進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)。
2. 失活反應(yīng)
反應(yīng)結(jié)束后，可加入終濃度 10mM EDTA 終止反應(yīng)。或采用
加熱方式 85℃ 10min 加熱失活。
使用注意事項(xiàng)：
(1) 環(huán)化底物 ssDNA 或 RNA 必須帶有 5’磷酸基團(tuán)，3’端含有 OH。
(2) 環(huán)化體系中的 ATP 濃度高于 20μM 以上時(shí)會(huì)極大抑制環(huán)化效率，甚至導(dǎo)致環(huán)化失敗。因此建議底物為純化產(chǎn)物。
(3) 由于本酶提高了耐熱性，在 65℃條件下進(jìn)行連接反應(yīng)，在測(cè)試中 Betain 無(wú)益于連接效率提升。
(4) 本酶主要進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化連接，分子間的連接未檢測(cè)到。
(5) 本酶對(duì) ssDNA 和 RNA 的環(huán)化效率高，多數(shù)情況下，90%以上的底物被環(huán)化。未被環(huán)化的 ssDNA 可通過(guò)加入 5U的 Exonuclease I，37°C 消化 15min 去除，以獲得高純度的環(huán)化 ssDNA。未環(huán)化的 ssRNA，將稍后給出去除方案。
(6) 本酶可以連接 15nt 以上的核苷酸，更長(zhǎng)的產(chǎn)物連接參數(shù)，將稍后給出測(cè)試報(bào)告及 protocol。
(7) 對(duì)于連接底物量較少的實(shí)驗(yàn)來(lái)講，推薦縮小體系，而不是減少酶的用量。在小體系實(shí)驗(yàn)時(shí)注意體系的蒸發(fā)，可加入礦物油以防止蒸發(fā)。

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