做蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，有時(shí)候?qū)嶒?yàn)會(huì)覺(jué)得參考實(shí)驗(yàn)方法和ke隆的蛋白基因序列沒(méi)有問(wèn)題，蛋白電泳就是沒(méi)有結(jié)果。今天就一起來(lái)探討一下蛋白質(zhì)不表達(dá)的原因有哪些呢？
1.載體構(gòu)建錯(cuò)誤
這個(gè)屢見(jiàn)不鮮，很多新人經(jīng)常弄錯(cuò)讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體，其ke隆位點(diǎn)常有一兩個(gè)堿基的區(qū)別；另外有些酶產(chǎn)生粘端有些酶產(chǎn)生平端，這些都容易導(dǎo)致讀碼框錯(cuò)誤，從而表達(dá)不出來(lái)。
2.宿主菌選擇不當(dāng)
不同的宿主菌其基因型是不一樣的。有些經(jīng)過(guò)特殊修飾的載體，或者特殊用途的載體，或者有特殊啟動(dòng)子的載體，必須選擇合適的宿主菌進(jìn)行表達(dá)。因此，當(dāng)你的蛋白沒(méi)有表達(dá)出來(lái)時(shí)，可以考慮更換宿主菌。
3.密碼子的使用頻率低
有些基因其本身含有許多稀有密碼子，尤其是起始密碼之后的15個(gè)堿基之內(nèi)的稀有密碼子，對(duì)蛋白表達(dá)有著很重要的影響。優(yōu)化密碼子對(duì)原核表達(dá)似乎效果很好，對(duì)真核表達(dá)系統(tǒng)未見(jiàn)得有很好的效果。曾經(jīng)有某人在畢赤酵母表達(dá)某蛋白兩年未果，試圖將密碼子優(yōu)化進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果還是沒(méi)有表達(dá)。一氣之下將該優(yōu)化的基因序列克隆到原核表達(dá)載體，表達(dá)量居然出奇地高！這是一個(gè)辛酸的笑話，但是一個(gè)真實(shí)的故事。但是有一點(diǎn)我可以有很大把握的說(shuō)：對(duì)于真核表達(dá)，密碼子優(yōu)化只能起錦上添花的作用（確認(rèn)有表達(dá)，以此來(lái)提高表達(dá)量），而不能雪中送炭（沒(méi)有表達(dá)出來(lái)，通過(guò)密碼子優(yōu)化極有可能不奏效）。
4.質(zhì)粒不穩(wěn)定或者質(zhì)粒丟失
pET系統(tǒng)通常比較穩(wěn)定。但是你選用帶氨芐青霉su抗性的載體時(shí)，也許有可能產(chǎn)生β-lactamase降解了抗生素，使質(zhì)粒丟失。還有一種情況是表達(dá)重組的毒素蛋白，對(duì)宿主細(xì)胞也有毒性，造成質(zhì)粒丟失。這種情況多見(jiàn)于真核表達(dá)系統(tǒng)。
5.蛋白酶將蛋白降解了
這種情況常由重組蛋白本身的N-或C-端序列引起的。當(dāng)?shù)鞍譔-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr這些氨基酸時(shí)，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端規(guī)則。N-端是Met時(shí)，大腸桿菌可以悄悄地把這個(gè)Met偷走，特別是Met后緊跟著一個(gè)帶小側(cè)鏈的氨基酸時(shí)。C-末端存在非極性氨基酸時(shí)，也容易導(dǎo)致蛋白被降解。C末端最后5個(gè)氨基酸是極性的或者帶電荷的，則不易被降解。
6.二級(jí)翻譯起始位點(diǎn)
這種情況見(jiàn)于你的序列里正好含有和核糖體結(jié)合位點(diǎn)一致的序列。那就怪不得人家了，核糖體會(huì)很高興地找到這個(gè)位點(diǎn)，然后開(kāi)始翻譯，致使你的蛋白被截短，在電泳時(shí)看不到預(yù)期大小的片段。
7.SD序列
這個(gè)不陌生吧？考研時(shí)老師喜歡出名詞解釋?zhuān)搽y怪人家老是拿這個(gè)出題----SD序列和起始密碼子序列（80%是AUG，也有GUG的）之間的距離，對(duì)蛋白表達(dá)的效率也有著非常重要的影響。SD序列本身的組成對(duì)翻譯效率也有影響。有時(shí)為了減少包涵體的產(chǎn)生，還特別對(duì)SD序列進(jìn)行修飾呢！
8.mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)
在克隆之前，你得看看你的序列里是否有和核糖體結(jié)合位點(diǎn)和/或翻譯起始位點(diǎn)互補(bǔ)的序列。如然，你最好進(jìn)行同義密碼子替換。否則由此形成的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，會(huì)讓翻譯嘎然而止的。
9.意外終止
這種情況見(jiàn)于PCR擴(kuò)增序列時(shí)，會(huì)和你開(kāi)個(gè)不大不小的玩笑。比如它會(huì)將序列中間TAC突變?yōu)門(mén)AA，讓你的蛋白翻譯剎車(chē)。所以在進(jìn)行表達(dá)之前，一定要進(jìn)行測(cè)序，避免這種情況的發(fā)生。
10.轉(zhuǎn)錄終止子
轉(zhuǎn)錄終止子的存在可以促進(jìn)蛋白表達(dá)；但是缺少時(shí)就會(huì)造成“通讀"，沒(méi)完沒(méi)了地讀下去。這在pET系統(tǒng)里不成問(wèn)題，因?yàn)樗诎谢虻南喾捶较蛴袀€(gè)選擇性的標(biāo)記基因。如果你的靶基因正好和這個(gè)標(biāo)記基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。如果沒(méi)有的話，它們會(huì)競(jìng)爭(zhēng)得天昏地暗，搶著生成mRNA和蛋白質(zhì)。
11.mRNA的不穩(wěn)定性
靶基因的mRNA常聚集于細(xì)胞內(nèi)。但是大腸菌的mRNA及其不穩(wěn)定。如果在mRNA的5"-非翻譯區(qū)和3‘-rho非依賴性終止子處插入穩(wěn)定結(jié)構(gòu)序列，可以促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定性。尤其是5"末端要是有個(gè)不帶突出的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能讓mRNA在胞漿內(nèi)無(wú)生命之虞。
12.檢測(cè)方法的可行性
有時(shí)候，蛋白的確表達(dá)了，只是表達(dá)量特別低，或者和雜帶靠得特別近，致使你錯(cuò)誤地以為蛋白沒(méi)有表達(dá)。這時(shí)候，你可千萬(wàn)別忘記了生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的兩大黃金準(zhǔn)則：對(duì)照和重復(fù)。說(shuō)到對(duì)照，有很多層意思。最基本的意思是，要設(shè)立空載體對(duì)照。在真核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白，常常量特別低。因此你不要老是想著WB和SDS-PAGE去檢測(cè)。這時(shí)候，你必須多看文獻(xiàn)，另辟蹊徑，從文獻(xiàn)中找找看這個(gè)蛋白有米有很特別的性質(zhì)----比如說(shuō)如果它具有酶活性，那簡(jiǎn)直就是便宜你了。還比如說(shuō)，某些蛋白具有異樣性質(zhì)，比如說(shuō)流感病毒的HA，你拿表達(dá)的不同梯度稀釋的蛋白做個(gè)血凝。如果發(fā)生血凝，并且呈現(xiàn)一定的梯度關(guān)系，那簡(jiǎn)直就是板上釘釘?shù)氖虑榱恕?/span>
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