一、基本原理
細(xì)胞凋亡檢測早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，目前早期識(shí)別仍有困難。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰*（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對(duì)PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用Annexin V結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗(yàn)以檢測細(xì)胞膜的完整性的檢測方法。
二、試劑與儀器
1、孵育緩沖液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2
2、標(biāo)記液：將FITC- Annexin V（寶靈曼公司產(chǎn)品）和PI加入到孵育緩沖液中，終濃度均為1ug/ml
3、流式細(xì)胞儀
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞直接收集到10ml的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為（1~5）×106，/mL 500~1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。
2、用孵育緩沖液洗滌1次，500~1000r/min離心5min。
3、用100ul的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10~15min。
4、500~1000r/min離心5min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。
5、加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不時(shí)振動(dòng)。
6、流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488nm，用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560nm的濾器檢測PI。
7、結(jié)果判斷：凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡檢測的早期PI不會(huì)著染而沒有紅色熒光信號(hào)。正?；罴?xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。
HPLC法含量測定    100mg    100574-200401    *
含量測定    100mg    100575-200903    *鈉
含量測定    50mg    100578-200401    異煙肼
含量測定    100mg    100580-200501    *
含量測定    100mg    100581-200501    *
UV法含量測定    50mg    100583-200401    *
HPLC法含量測定    100mg    100584-200401    *
含量測定    100mg    100585- 201003     *
含量測定    100mg    100586-200401    *
檢查用    50mg    100587-200901    雙硫化物
細(xì)胞凋亡檢測