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分秒必爭，賽默飛Orbitrap質(zhì)譜參與xin冠抗疫研究

                                    關(guān)注我們，更多干貨和驚喜好禮

    賽默飛世爾，作為抗疫先鋒之一，在背后助力科學(xué)家的研究，守護(hù)我們的健康 ，讓世界更安全。

由SARS-CoV-2（2型嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒）引起的新型冠狀病毒肺炎（COVID-2019）具有高傳染性，新型冠狀病毒肺炎在中國和的迅速傳播引發(fā)了衛(wèi)生緊急情況。ding尖的科學(xué)家針對xin冠病毒進(jìn)行爭分奪秒的研究，利用Orbitrap質(zhì)譜技術(shù)參與分析病毒相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)，病毒感染機(jī)制等內(nèi)容，本文將討論Orbitrap高分辨質(zhì)譜在xin冠病毒感染致病等機(jī)制的亮點(diǎn)研究及技術(shù)進(jìn)展。

1. 靶向蛋白定量方法監(jiān)測xin冠病毒蛋白動態(tài)變化

Orbitrap Eclipse高靈敏度平行反應(yīng)監(jiān)測靶向定量xin冠病毒蛋白

2019年美國質(zhì)譜年會，賽默飛重磅推出三合一系列的創(chuàng)新之作——Thermo Scientific^TM Orbitrap Eclipse^TM 質(zhì)譜儀，旨在解決生物學(xué)研究中的分析難題，輕松應(yīng)對蛋白質(zhì)組學(xué)，生物制藥與蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)分析研究中的各項(xiàng)挑戰(zhàn)，推出不久即投入到xin冠病毒研究中。

近，荷蘭鹿特丹伊拉斯馬斯大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)使用 Orbitrap Eclipse檢測SARS-CoV-2病毒蛋白肽段序列，作為潛在的診斷工具。作者利用easy1200液相和Eclipse質(zhì)譜使用靶向方法-平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）追蹤病毒感染Vero細(xì)胞后，幾種SARS-CoV-2蛋白的肽段變化。作者研究了SARS-CoV-2蛋白PRM實(shí)驗(yàn)的檢測限，主要是核衣殼蛋白（NCAP），這是zui豐富的病毒蛋白，因此是比較好的候選測試分子。Orbitrap Eclipse 質(zhì)譜的PRM結(jié)果顯示對該蛋白靈敏度可達(dá)到amol級別，大約為0.9pg。粗略計(jì)算表明，這種靈敏度水平應(yīng)足以檢測理論上與約10000個SARS-CoV-2顆粒相對應(yīng)的蛋白量。且其他SARS-CoV-2蛋白也是PRM靶向方法的良好候選蛋白^[1]。

圖. Orbitrap Eclipse靶向PRM監(jiān)測SARS-CoV-2病毒蛋白肽段序列

此外作者還在進(jìn)行了整體蛋白質(zhì)組學(xué)分析。在60-90分鐘分析時間內(nèi)，共鑒定出6500種相關(guān)蛋白質(zhì)。這表明蛋白質(zhì)組學(xué)可以用來研究病毒感染宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)組，是未來新興的研究工具。

2. 蛋白質(zhì)組學(xué)研究xin冠病毒感染的調(diào)控機(jī)制研究

2.1 Orbitrap 高分辨質(zhì)譜研究病毒宿主相互作用蛋白揭示感染機(jī)制

SARS-CoV-2病毒的基因組有29811個核苷酸，可編碼28-29個蛋白質(zhì)。其中一個蛋白質(zhì)E 是一種包膜蛋白，是有助于形成病毒油泡的結(jié)構(gòu)蛋白。一旦病毒進(jìn)入細(xì)胞，它還有其他的功能。例如，附著在蛋白質(zhì)上，有助于打開和關(guān)閉我們自己的基因。當(dāng)E蛋白干擾時，模式可能會改變。VISTARA BIOSCIENCE研究人員近進(jìn)行一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)E與寄主細(xì)胞中的溴多胺蛋白結(jié)合。Bromodomain 4（BRD4）是BET亞家族蛋白，通過識別乙酰化組蛋白提供了一個招募平臺作用，與非組蛋白靶點(diǎn)相關(guān)，除與病毒蛋白復(fù)合外，還參與NFKB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、Myc調(diào)控。此外，BRD4還與其它bromodomain蛋白存在協(xié)同作用，其中一些還可能執(zhí)行泛素化功能。另有一位作者使用QE HFX質(zhì)譜描述了BRD4相互作用蛋白的分子表型，使用了經(jīng)BET抑制劑、與BRD4結(jié)合的化合物以及可能的其他bromodomain蛋白處理的人類B細(xì)胞系蛋白質(zhì)組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，已鑒定的蛋白定位于SARS-CoV-2病毒感染細(xì)胞的相互作用重編程途徑和復(fù)合物中[2]，如下圖所示。

圖. 蛋白組學(xué)分析SARS-CoV-2病毒感染細(xì)胞后BRD4相關(guān)互作蛋白

2.2. Q Exactive HF質(zhì)譜非標(biāo)定量技術(shù)監(jiān)控病毒感染細(xì)胞實(shí)時變化

法國巴黎薩克利大學(xué)團(tuán)隊(duì)，通過使用Thermo ScientificTM Orbitrap Q Exactive HFTM質(zhì)譜進(jìn)行niao槍法蛋白質(zhì)組學(xué)研究，獲得了 SARS-CoV-2感染的相關(guān)信息，確定了病毒顆?？乖a(chǎn)生的*條件。技術(shù)流程如下圖所示。

作者用SARS-CoV-2感染Vero E6細(xì)胞（MOI 0.01和0.001）。然后用LFQ（非標(biāo)記定量方法）方法在幾天內(nèi)監(jiān)測感染的實(shí)時變化。總共鑒定了3220個Vero細(xì)胞蛋白和6個SARS-CoV-2蛋白，以及27388個Vero細(xì)胞和94個病毒特異肽段（FDR<1%）。病毒蛋白水平在不同時間點(diǎn)的動態(tài)變化表明，SARS-CoV-2蛋白合成在感染后持續(xù)增加，在感染第3天左右達(dá)到大值。為了評估質(zhì)譜獲得的病毒圖譜在多大程度上反映了病毒的產(chǎn)生，作者通過qPCR在同一時間點(diǎn)測量了SARS-CoV-2 RNA分子，觀察到了極為豐富的病毒蛋白產(chǎn)量的變化[3]，從而證實(shí)可以使用基于質(zhì)譜的LFQ非標(biāo)定量法監(jiān)測SARS-CoV-2的感染動力學(xué)。

圖. Q Exactive HF質(zhì)譜進(jìn)行niao槍法蛋白質(zhì)組學(xué)研究SARS-CoV-2感染的相關(guān)蛋白

3. Orbitrap高分辨質(zhì)譜針對xin冠病毒糖蛋白結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

3.1. Orbitrap Fusion質(zhì)譜結(jié)合冷凍電鏡解析SARS-CoV-2 S糖蛋白多糖結(jié)構(gòu)

來自CCRC的Robert Woods實(shí)驗(yàn)室通過大量實(shí)驗(yàn)生成了 SARS-CoV-2 S糖蛋白上的聚糖三維結(jié)構(gòu)。整個研究基于所報(bào)道的S蛋白3D結(jié)構(gòu)和相關(guān)的糖組學(xué)數(shù)據(jù)[4]，由賽默飛冷凍電鏡Cryo_EM 以及Thermo ScientificTM Orbitrap FusionTM 質(zhì)譜結(jié)合分析。

他們進(jìn)行了分子動力學(xué)模擬，以觀察多糖的微觀異質(zhì)性對表位暴露的影響。模糊位置為聚糖結(jié)構(gòu)。M9型（綠色），M5型（深黃色），混合型（橙色），復(fù)合型（粉色）。

圖. SARS-CoV-2 S糖蛋白聚糖結(jié)構(gòu)和多糖微觀異質(zhì)性

3.2. Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜繪制xin冠病毒SARS-CoV-2 S蛋白糖基化圖譜

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）中的刺突蛋白（Spike蛋白）是一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，是病毒結(jié)合和進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是研發(fā)抗體及相關(guān)藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)。該蛋白的位點(diǎn)特異性N-糖基化修飾（包含糖基化位點(diǎn)和糖鏈信息）分析對于了解其功能和藥物研發(fā)具有重要意義。四川大學(xué)華西醫(yī)院科研團(tuán)隊(duì)針對該蛋白的位點(diǎn)特異性N-糖基化修飾進(jìn)行深入分析[5]，具體實(shí)驗(yàn)流程如下。

圖. 利用Orbitrap質(zhì)譜分析xin冠病毒S蛋白N-糖基化流程

 通過使用Thermo ScientificTM Orbitrap FusionTM LumosTM質(zhì)譜技術(shù)的整合糖蛋白質(zhì)組學(xué)新方法，繪制了xin冠病毒SARS-CoV-2重組表達(dá)蛋白的所有N糖基化修飾位點(diǎn)以及位點(diǎn)特異性的N-糖鏈組成圖譜，如下圖所示。

圖. S糖蛋白位點(diǎn)特異性N糖基化位點(diǎn)修飾譜

4. 蛋白質(zhì)組結(jié)合代謝組研究xin冠病毒感染病人血清生物標(biāo)志物

多組學(xué)方法研究xin冠肺炎輕重癥患者血清中蛋白和代謝生物標(biāo)志物

西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院與合作團(tuán)隊(duì)對xin冠肺炎患者血液中的蛋白質(zhì)和代謝物分子進(jìn)行系統(tǒng)檢測，利用多組學(xué)方法研究重癥患者血清的多種蛋白和代謝物分子表型，尋找潛在生物標(biāo)志物，有望為預(yù)測輕癥患者向重癥發(fā)展提供導(dǎo)向。

實(shí)驗(yàn)對99例病毒滅活處理的血清樣本進(jìn)行了安全處理和Orbitrap質(zhì)譜分析。根據(jù)現(xiàn)行臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，樣本被分為對照（健康）組、普通流感組、xin冠感染輕癥組、xin冠感染重癥組。運(yùn)用QE HF質(zhì)譜對血清樣本中的蛋白質(zhì)和代謝物的相對濃度進(jìn)行整體分析[6]，揭示重癥患者體內(nèi)多種分子調(diào)控，具體流程如下圖所示。

圖. 蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合代謝組學(xué)圍繞xin冠肺炎患者隊(duì)列進(jìn)行分析流程

與對照（健康）組、普通流感組和輕癥組相比，xin冠肺炎重癥患者的樣本中出現(xiàn)了93種*的蛋白表達(dá)和204個特征性改變的代謝分子。其中50種蛋白，與患者體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、補(bǔ)體系統(tǒng)、血小板脫顆粒有關(guān)。研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，在xin冠病毒感染的重癥患者體內(nèi)，有100多種氨基酸及100多種脂質(zhì)均顯著減少。見下圖。

圖. COVID-2019感染后重癥患者體內(nèi)的巨噬細(xì)胞等通路蛋白質(zhì)和代謝物變化

基于Orbitrap質(zhì)譜技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)分析方法，短時間內(nèi)整合蛋白質(zhì)組、臨床、生物、代謝組、計(jì)算等多學(xué)科數(shù)據(jù)篩選出重癥患者特征性的22個蛋白質(zhì)和7個代謝物，有望可以輔助現(xiàn)有的診斷分析手段，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)、高效的治療。

新型冠狀病毒肺炎疫情來勢洶洶，牽動著每一個人的心，在這沒有硝煙的抗疫戰(zhàn)場上，白衣天使和醫(yī)學(xué)研究者都是勇敢的戰(zhàn)士。賽默飛也在以自己的力量全力支持國內(nèi)的xin冠病毒科學(xué)研究，我們整理了基于Orbitrap超高分辨質(zhì)譜技術(shù)在xin冠病毒相關(guān)的亮點(diǎn)研究，謹(jǐn)以此文致敬白衣天使和深耕醫(yī)學(xué)研究的學(xué)者們，默默付出，勇敢向前。

參考文獻(xiàn)

[1] TARGETED PROTEOMICS FOR THE DETECTION OF SARS-COV-2 PROTEINS,  wangzhi:biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.23.057810v1

[2] A proteomic model of SARS-COV2 infection by comparing the interactomes of BRD4 with BET-inhibition and SARS-COV2 viral proteins – implications for re-purposing approved drugs or ubiquitin-mediated degradation of select candidates，DOI:10.21203/rs.3.rs-24573/v1

[3] Shotgun proteomics of SARS-CoV-2 infected cells and its application to the optimisation of whole viral particle antigen production for vaccines, wangzhi:.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.17.046193v1

[4] 3D Models of glycosylated SARS-CoV-2 spike protein suggest challenges and opportunities for vaccine development, doi: wangzhi:doi.org/10.1101/2020.04.07.030445

[5] Site-specific N-glycosylation Characterization of Recombinant SARS-CoV-2 Spike Proteins using High-Resolution Mass Spectrometry, wangzhi:doi.org/10.1101/2020.03.28.013276.

[6] Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-2019 Patient Sera, wangzhi:medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.07.20054585v1

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