?樣品要求及注意事項(xiàng)：
1、 如果提供實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)材料必須保證新鮮，請(qǐng)您采樣后立刻放入液氮中速凍或加入樣穩(wěn)定劑，并用干冰運(yùn)輸。
2、 如果樣品可以用Trigol法提總RNA ，也可以將樣品研磨后放在 Trigol中，動(dòng)植物組織 ： 50～100mg/mlTrigol，貼壁細(xì)胞：10cm2/mlTrigol，懸浮細(xì)胞：5×106動(dòng)植物，酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞10×107/mlTrigol。
3、 如果提供RNA或cDNA我們要對(duì)您提供的材料進(jìn)行評(píng)估。
4、 實(shí)時(shí)熒光定量PCR服務(wù)您一定要提供樣品及要擴(kuò)增基因的詳細(xì)信息。

馬虻探針法熒光定量PCR試劑盒運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。使用本試劑盒提供的陽性對(duì)照時(shí)，由于其濃度較高，一定要注意不要污染其他試劑和成分。在專門的區(qū)域操作。

儲(chǔ)存條件：
14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，產(chǎn)品僅用于科研請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
相對(duì)定量簡介：
分析方法： ①雙標(biāo)曲法 ②2 － △Ct ③2 － △△Ct ④Pfaffi法
①雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法簡介
公式：
優(yōu)點(diǎn)：分析簡單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化簡單
缺點(diǎn)：對(duì)每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線；必需有固定的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線；這些標(biāo)準(zhǔn)品并不代表樣品擴(kuò)增的真實(shí)狀態(tài)應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中與*的兩種相對(duì)定量方法之一

實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保溫7min。
3：結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

熒光定量PCR檢測(cè)方法包括以下步驟：
(1)產(chǎn)品僅用于科研將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2)待測(cè)樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。
其中步驟(1)為：將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
其中所述參照基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴(kuò)增區(qū)域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測(cè)目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題，提高HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)的可靠性。
步驟(2)為：待測(cè)樣本與步(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。
其中所述待測(cè)目的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)待測(cè)目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴(kuò)增區(qū)域，所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增方法，所述熒光定量PCR擴(kuò)增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴(kuò)增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴(kuò)增。

Picrolonic acid4-硝基-3-基對(duì)基-5-吡唑啉0.5毫升高純，99%

Picloram毒莠定10U高純，99%

PI化錠10毫升AR

Phytic acid sodium salt hydrate肌醇六磷100克特純，

Phytic acid dodecasodium salt hydrate水合植十二1公斤CP，

Phytic acid肌醇六磷10克GR，99.8%

Phytase from wheat肌醇六磷酶250克超純，

Phytagel冷結(jié)樹酯100次/包AR，

p-Hydroxybenzoic acid4-羥基0.25毫升超純，99%

Phthlandione酐25克AR，

Phthalide鄰羥基內(nèi)酯100克CP，

Phosphotungstic acid hydrate磷鎢水合物100克指示劑

Phosphotransacetylase from Bacillus stearothermophilus磷酰轉(zhuǎn)移酶1公斤BR，100-300u/mg

Phosphorylase b from rabbit muscle磷化酶B(兔肌)25克BR，1200u/mg

Phosphoramidon disodium salt磷米5毫克超純，90%

雞豆黃素A  英文名稱：5,7-Dihydrox -4'-methoxyisoflavone  號(hào)：491-80-5  規(guī)格：20mg

當(dāng)藥寧  英文名稱：Swertianin  號(hào)：20882-75-1  規(guī)格：10mg

甲基當(dāng)藥寧  英文名稱：Methylswertianin  號(hào)：22172-17-4  規(guī)格：10mg

訶子鞣質(zhì)    英文名稱：Chebulagic acid  號(hào)：23094-71-5  規(guī)格：10mg

焦袂康  英文名稱：3-hydroxy-4H-pyran-4-one   號(hào)：496-63-9   規(guī)格：20mg

5-O-甲基維斯阿米醇苷  英文名稱：5-O-Methylvisammioside  號(hào)：84272-85-5  規(guī)格：20mg

4-甲氧基水楊  英文名稱：4-Methoxysalicylic acid  號(hào)：2237-36-7  規(guī)格：20mg

咖啡  英文名稱：Caffeic acid  號(hào)：331-39-5  規(guī)格：20mg

柯里拉京  英文名稱：Corilagin  號(hào)：23094-69-1  規(guī)格：20mg

熊果  英文名稱：Ursolic acid  號(hào)：77-52-1  規(guī)格：20mg
馬虻探針法熒光定量PCR試劑盒Amiloridehydrochloride　鹽酸阿米洛利(標(biāo)準(zhǔn)品)　規(guī)格：HPLC≥99.0%,標(biāo)準(zhǔn)品

Mehyl3,5-diamino-6-chloropyrazine-2-carboxyla　3，5-二氨基-6-氯吡嗪-2-羧酸甲酯（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLC≥99.5%，標(biāo)準(zhǔn)品

Pizoifen　苯噻啶（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLCgrade

β-Cyclodexrin　β-環(huán)糊精（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定

CapoprilDisulfide　卡托普利二硫化物（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定

Clioquinol　氯碘羥喹（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定

Alburolsulfa　硫酸沙丁胺醇（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定

Dehydroepiandrosrone-3-sulfa　硫酸普拉睪酮鈉（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定

Primidone　撲米酮（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定

Zincglucona　葡萄糖酸鋅（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定

riamcinolone　曲安西龍（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定

Sulindac　舒林酸（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定

NVP-HSP990　HSP990　規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定

olazolineHCl　鹽酸妥拉唑林（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定

hioridazinehydrochloride　鹽酸硫利達(dá)嗪（標(biāo)準(zhǔn)品）　規(guī)格：HPLC法含量測(cè)定