ATCC細(xì)胞真核雙基因共表達(dá)載體phTERT-IRES-SV40轉(zhuǎn)染bMGEs, 48 h后用G418抗性藥物加壓篩選。約3周后, 獲得陽性克隆, 命名為HL-bMGEs, 挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)(圖3)。獲得的單克隆以“鋪路石”樣細(xì)胞類型生長。繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng), 細(xì)胞仍以緊密單層生長方式增殖, 細(xì)胞體外持續(xù)培養(yǎng)達(dá)30代依然生長旺盛。

轉(zhuǎn)染后陽性克隆的RT-PCR鑒定

分別從篩選出的陽性細(xì)胞HL-bMGEs和未轉(zhuǎn)染的bMEGs中提取基因組mRNA, RT-PCR擴(kuò)增hTERT 和SV40 LT, 陽性細(xì)胞基因擴(kuò)增的產(chǎn)物長度為3.45 Kb 和363 bp, 未處理組為陰性結(jié)果, 所得結(jié)果與預(yù)期的一致。

Western blot鑒定phTERT-IRES-SV40陽性克隆

Western blot檢測結(jié)果表明, 第15代陽性細(xì)胞 HL-bMGEs中的hTERT和SV40 LT均能正常表達(dá), 蛋白分子量為125 kDa和94 kDa。陰性細(xì)胞bMGEs中 hTERT和SV40 LT不表達(dá)。內(nèi)參β-action在陽性細(xì)胞和對照均穩(wěn)定表達(dá), 蛋白分子量為43 kDa。

流式細(xì)胞鑒定陽性細(xì)胞增殖能力

利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行陽性細(xì)胞周期分析。隨機(jī)選取第10代HL-bMGEs, 對照組為未轉(zhuǎn)染phTERTIRES-SV40、正常培養(yǎng)的bMGEs第10代。通過流式ATCC細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析表明, HL-bMGEs的細(xì)胞周期活動是從G0/G1期向G2期過渡, 處于S期細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)為27.2%, 陽性細(xì)胞中第10代細(xì)胞S期相對較高。對照組的細(xì)胞大部分處于G0期, 處于S期細(xì)胞則相比較低(對照組為10.7%)。結(jié)果表明, 陽性細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力。
甲基斑蝥胺    HPLC法含量測定    50mg    100465-200401
呋喃唑酮    含量測定    100mg    100466-200401
嗎多明    含量測定    100mg    100467-200701
替加氟    HPLC法含量測定    50mg    100468-200401
尿嘧啶    HPLC法含量測定    50mg    100469-200401
檸檬烯    含量測定    200mg    100470-200701
溴丙胺太林    HPLC法含量測定    50mg    100471-200301
鹽酸妥洛特羅    HPLC法含量測定    50mg    100472-200401
鹽酸環(huán)侖特羅    UV法含量測定    50mg    100473-200401
溴甲東莨菪堿    含量測定    50mg    100476-200301
無水磷酸氫二鈉    含量測定    100mg    100480-200501
ATCC細(xì)胞