原代細(xì)胞基本概念通常，體外培養(yǎng)的生物成分無外乎兩種結(jié)構(gòu)形式：
其一是小塊組織或稱為組織塊（tissue block），一般稱為外植塊；
其二是將生物組織分散后制成的單個(gè)細(xì)胞，一般稱為分離的細(xì)胞(isolated cell)或者分散的細(xì)胞(dissociated cell)。
分散的過程通常在培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中進(jìn)行，分散的細(xì)胞被懸浮于培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中。
單個(gè)細(xì)胞分散存在于培養(yǎng)液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中，就稱為細(xì)胞懸液(cell suspension)。
狹義的細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)主要是指分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)，廣義的細(xì)胞培養(yǎng)的概念還包括單（個(gè)）細(xì)胞培養(yǎng)(single cell culture)。一種是群體培養(yǎng)（mass culture），將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層；另一種是克隆培養(yǎng)（clonal culture），將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生長增殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克?。╟lone）。一個(gè)細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來源于同一個(gè)祖先細(xì)胞。
現(xiàn)今，用于疫苗的細(xì)胞基本有3類，即原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株及傳代細(xì)胞系。經(jīng)過幾十年的研究和發(fā)展，目前我國已經(jīng)擁有了可以進(jìn)行大規(guī)模疫苗的動(dòng)物原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和Vero細(xì)胞等技術(shù)，用于多種人用、動(dòng)物疫苗。其中二倍體細(xì)胞（如我國70年代建立的人胚肺二倍體細(xì)胞株KMB17和2BS）對(duì)多種病毒具有廣泛的敏感性，用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細(xì)胞時(shí)在其培養(yǎng)物中可能存在的各種潛在致病因子的危險(xiǎn)，是當(dāng)前病毒性疫苗較為理想的細(xì)胞基質(zhì)。Vero細(xì)胞是1962年由日本Chiba大學(xué)的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的，是一種貼壁依賴性成纖維細(xì)胞，核型為2n 60，高倍體率約為1.7%，可持續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng)，不含任何污染因子。通常使用199培養(yǎng)基添加5%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。該細(xì)胞可用于多種病毒的增殖，已被WHO批準(zhǔn)廣泛用于人用、動(dòng)物用疫苗。
二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型
（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：
1、成纖維細(xì)胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞。
2、上皮型細(xì)胞：細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。
3、游走細(xì)胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。
4、多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。
（二）懸浮型:見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。
三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程:體內(nèi)細(xì)胞生長在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。每次傳代以后，細(xì)胞的生長和增殖過程都會(huì)受一定的影響。另外，很多細(xì)胞在體外的生存也不是無限的，存在著一個(gè)發(fā)展過程。所有這一切，使組織細(xì)胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點(diǎn)。
（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期（Life Span of Culture Cells）:所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機(jī)體的死亡衰老基本相一致。人胚二倍體成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，在不凍存和反復(fù)傳代條件下，可傳30～50代，相當(dāng)于150～300個(gè)細(xì)胞增殖周期，能維待一年左右的生存時(shí)間，Z后衰老凋亡（Apoptosis）。如供體為成體或衰老個(gè)體，則生存時(shí)間較短；如培養(yǎng)的為其它細(xì)胞,如肝細(xì)胞或腎細(xì)胞，生存時(shí)間更短，僅能傳幾代或十幾代。只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變。正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何，在細(xì)胞全生存過程中，大致都經(jīng)歷以下三個(gè)階段：
1、原代培養(yǎng)（Primary Culture）期：也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到*次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。
2、傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間Z長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（Diploid Cell Line）。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至*停止，原代細(xì)胞進(jìn)入第三期。
3、衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，Z后衰退凋亡。
在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系（Infinite Cell Line），也稱連續(xù)細(xì)胞系（Continuous Cell Line）。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。
（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期 所有體外培養(yǎng)細(xì)胞，包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系，當(dāng)生長達(dá)到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖速度等有關(guān)。接種細(xì)胞數(shù)量大、細(xì)胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下，細(xì)胞數(shù)量增加與飽和速度相對(duì)要快（實(shí)際上細(xì)胞接種數(shù)量大時(shí)細(xì)胞增殖速度比時(shí)要快）。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系比初代培養(yǎng)細(xì)胞增殖快，培養(yǎng)液中血清含量多時(shí)細(xì)胞增殖比少時(shí)快。以上情況都會(huì)縮短傳代時(shí)間。
所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增〔Doubling〕不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。
細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個(gè)階段：
1、潛伏期（Latent Phase）：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長達(dá)10～24小時(shí)或更多；連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快，10～30分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個(gè)非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細(xì)胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素（Fibronectin），又稱LETS（Larger External Transformation Substance），細(xì)胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面（如CSP），有的則來自培養(yǎng)基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細(xì)胞生長增殖條件之一。
細(xì)胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細(xì)胞，還要經(jīng)過一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí)，可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，基本無增殖，少見分裂相。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約24～96小時(shí)或更長，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。
2、指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：這是細(xì)胞增值Z旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動(dòng)對(duì)細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力的時(shí)期，因此是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的和Z主要的階段。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、Z后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。腫瘤細(xì)胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動(dòng)和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（Piled up）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。因此細(xì)胞接觸抑制和密度抑制是兩個(gè)不同的概念，不應(yīng)混淆。
3、停滯期（Stagnate Phase）：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。結(jié)果反而耽誤了時(shí)間，這是在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)特別注意的。
四、原代培養(yǎng):即*次培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。有幾方面含義：
培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿（瓶）中就不在分割，任其生長繁殖；
原代培養(yǎng)中的“代”并非細(xì)胞的“代”數(shù)，因?yàn)榕囵B(yǎng)過程中細(xì)胞經(jīng)多次分裂已經(jīng)產(chǎn)生多代子細(xì)胞；
原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液，也不等于不更換培養(yǎng)器皿。
原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細(xì)胞的生長就會(huì)出現(xiàn)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡。但是有極少數(shù)的細(xì)胞能夠度過“危機(jī)”而繼續(xù)傳下去，這些存活的細(xì)胞一般能夠傳到40～50代，這種傳代細(xì)胞叫做細(xì)胞株。細(xì)胞株的遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變,在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。當(dāng)細(xì)胞株傳至50代以后又會(huì)出現(xiàn)“危機(jī)”，不能再傳下去。但是有部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，并且?guī)в邪┳兊奶攸c(diǎn)，有可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。
原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系（株）必經(jīng)的階段，其是否成功與組織污染與否、供體年齡、培養(yǎng)技術(shù)和方法、適宜培養(yǎng)基的選擇等多種因素有關(guān)。由于原代培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化性極小，對(duì)病毒敏感性好，因此適應(yīng)制備疫苗等生物制品；但也存在有潛在外源因子、不能事先檢查標(biāo)本、且受供體年齡健康狀況的影響而導(dǎo)致批間差異大等缺陷。目前常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)有雞胚成纖維細(xì)胞及豬腎、猴腎、地鼠腎等原代細(xì)胞。
原代培養(yǎng)的基本過程包括取材、培養(yǎng)材料的制備、接種、加培養(yǎng)液、置培養(yǎng)條件下培養(yǎng)等步驟，在所有的操作過程中，都必須保持培養(yǎng)物及生長環(huán)境的無菌。
多數(shù)情況下，分散的細(xì)胞若屬于貼壁依賴型細(xì)胞，就能黏附、鋪展于培養(yǎng)器皿和載體表面生長而形成細(xì)胞單層，這種培養(yǎng)方式稱為單層細(xì)胞培養(yǎng)（monolayer culture），又叫貼壁培養(yǎng)（adherent culture）。少數(shù)情況下，培養(yǎng)的細(xì)胞沒有貼壁依賴性，可通過專門設(shè)備使細(xì)胞始終處于懸狀態(tài)而在體外生長，這種形式稱為懸浮培養(yǎng)（suspension culture）。如何讓接種的細(xì)胞盡快貼壁，是決定培養(yǎng)成功的關(guān)鍵步驟：
取決于適當(dāng)?shù)纳L基質(zhì)表面；
可降低接種后培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞的浮力，如先少補(bǔ)加少量培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁后再補(bǔ)足營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；
注意適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種密度，一般105個(gè)/ml左右。
五、傳代培養(yǎng):當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會(huì)因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時(shí)就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個(gè)過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對(duì)單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。
體外培養(yǎng)技術(shù)中所謂的傳“代”概念并不等于細(xì)胞生物學(xué)中“親代細(xì)胞”與“子代細(xì)胞”中“代”的概念。傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是分割后再一次培養(yǎng)，可以相對(duì)地衡量培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡。
六、生長曲線:細(xì)胞接種入培養(yǎng)瓶后，先進(jìn)入2-24h的延遲期（lag period），然后進(jìn)入指數(shù)生長期（即對(duì)數(shù)期）（log phase），匯合成單層進(jìn)入緩慢生長或停滯期（即平臺(tái)期）（plateau lhase）。每種原代細(xì)胞的這些生長期（growth phase）都是特征性的，只要環(huán)境條件保持恒定，每一次測定結(jié)果應(yīng)該是可重復(fù)的。