瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的實(shí)驗(yàn)原理

[實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備]

1. elisa定量檢測(cè)試劑盒恒溫培養(yǎng)箱 2. 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)

3. 高壓滅菌鍋 4. 紫外線透射儀

[實(shí)驗(yàn)材料]

1.三羥甲基氨基甲烷(Tris) 2.硼酸

3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚藍(lán)

5.蔗糖 6.瓊脂糖

7.溴化乙錠 8.DNA marker

9.DNA樣品

[實(shí)驗(yàn)步驟]

1.緩沖液的配制

① 5×TBE(5倍體積的TBE貯存液)

配1000ml 5×TBE:

Tris 54g

硼酸 27.5g

0.5mol/l EDTA 20ml

Ph8.0

② 凝膠加樣緩沖液(6×)

溴酚藍(lán) 0.25%

蔗糖 40%

③溴化乙錠溶液(EB) 0.5μg/ml

2.制備瓊脂糖凝膠

按照被分離DNA的大小,決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：

瓊脂糖凝膠濃度 線性DNA的有效分離范圍

0.3% 5-60 kb

0.6% 1-20 kb

0.7% 0.8-10 kb

0.9% 0.5-7 kb

1.2% 0.4-6 kb

1.5% 0.2-4 kb

2.0% 0.1-3 kb

3.膠板的制備

(1)elisa定量檢測(cè)試劑盒 用高壓滅菌指示紙帶將洗靜、干燥的玻璃板的邊緣(或電泳裝置所皿備的塑料盤的開口)封住，形成一個(gè)膠膜(將膠膜放在工作臺(tái)的水平位置上，用水平儀校正)。

(2) 配制足夠用于灌滿電泳槽和制備凝膠所需的電泳緩沖液(1×TBE)。準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉。緩沖液不宜超過錐瓶或玻璃瓶的50%容量。 在電泳槽和凝膠中務(wù)必使用同一批次的電泳緩沖液，離子強(qiáng)度或pH值的微小差異會(huì)在凝膠中形成前沿，從而大大影響DNA段的遷移率 。

(3) 在錐瓶的瓶頸上松松地包上一層厚紙。如用玻璃瓶，瓶蓋須擰松。在沸水浴或微波爐中將懸浮加熱至瓊脂糖溶解。注意：瓊脂糖溶液若在微波爐里加熱過長(zhǎng)時(shí)間，溶液將過熱并暴沸。應(yīng)核對(duì)溶液的體積在煮沸過程中是否由于蒸發(fā)而減少，必要時(shí)用緩沖液補(bǔ)充。

(4) 使溶液冷卻至60℃。加入溴化乙錠(用水配制成10mg/ml的貯存液)到終濃度為0.5ug/ml，充分混勻。

(5) 用移液器吸取少量瓊脂糖溶液封固膠模邊緣，凝固后，在距離底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入瓊脂糖后可以形成完好的加樣孔。如果梳子距玻璃板太近，則拔出梳子時(shí)孔底將有破裂的危險(xiǎn)，破裂后會(huì)使樣品從玻璃板之間滲透。

(6)將剩余的溫?zé)岘傊侨芤旱谷肽z模中。凝膠的厚度在3-5mm之間。檢查一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。

(7)在凝膠*凝固后(于室溫放置30-45分鐘) ，小心移去梳子和高壓滅菌紙帶，將凝膠放入電泳槽中。

低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠及濃度低于0.5%的瓊脂糖凝膠應(yīng)冷卻至4℃，并在冷庫中電泳。

(8)加入恰好沒過膠面約1mm深的足量電泳緩沖液。

4.加樣

DNA樣品與所需加樣緩沖液混合后，用微量移液器，慢慢將混合物加至樣品槽中。此時(shí)凝膠已浸沒在緩沖液中。 一個(gè)加樣孔的大加樣量依據(jù)DNA的數(shù)量及大小而定，一般為20-30μl樣品。

已知大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)，elisa定量檢測(cè)試劑盒應(yīng)同時(shí)加在凝膠的左凝膠的左側(cè)和右側(cè)孔內(nèi)。確定未知DNA的大小。測(cè)量未知DNA的大小時(shí)，要所有樣品都用相同的樣品緩沖液。