elisa定量檢測(cè)試劑盒Northern轉(zhuǎn)膜操作步驟

elisa定量檢測(cè)試劑盒轉(zhuǎn)膜前的RNA瓊脂糖凝膠電泳參照RNA分離中的電泳方法，根據(jù)需要選用適當(dāng)?shù)?分子量Marker.

1.在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)變性凝膠電泳完成后，凝膠用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于 2×SSC(20×SSC用DMPC-H2O稀釋)中浸泡15～30min.。

2.構(gòu)建轉(zhuǎn)移平臺(tái)：在塑料盒上橫放一塊玻璃板，玻璃板應(yīng)比塑料盒長，但比塑料盒窄。剪一塊與盒子等寬但長度是盒子長度2倍的濾紙，將其橫放在玻璃板上，濾紙兩頭垂入盤中，用20×SSC浸濕濾紙，并向盤中加入足量的20×SSC。

3.用鋒利的小刀將凝膠邊緣無用部分修去，并在靠加樣孔的一放左上角切去一小塊作為凝膠方位的記號(hào)。將凝膠置于平臺(tái)中央，用玻棒滾動(dòng)除去氣泡，然后用石蠟?zāi)し庾∧z四周邊緣，避免覆蓋樣品部位。

4.剪一片與凝膠暴露面同樣大小的尼龍膜，在無RNase的水中浸泡5min.，然后將其放置在凝膠上面，膜的一條邊緣應(yīng)剛好重疊覆蓋于加樣孔的邊緣。膜置于凝膠表面后即不應(yīng)輕易挪動(dòng)，膜與凝膠之間不應(yīng)留有氣泡。

5.取兩張與尼龍膜同樣大小的濾紙，elisa定量檢測(cè)試劑盒用20×SSC浸濕后置于膜的上方，用玻棒趕出氣泡。切一疊略小于濾紙的紙巾，將其置于濾紙上方，在紙巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上壓一重物，室溫下轉(zhuǎn)膜4～6小時(shí)或4℃過夜。

在轉(zhuǎn)膜過程中，要保證塑料盤中有足夠的20×SSC，當(dāng)紙巾浸濕后，要及時(shí)更換。

6.拆卸轉(zhuǎn)膜裝置，翻轉(zhuǎn)凝膠和膜使凝膠的一面朝上，置于一張干的濾紙上，用軟鉛筆在膜上標(biāo)記凝膠加樣孔的位置。

7.取下凝膠，用2×SSC洗膜，再置于兩張干濾紙上使膜晾干。

8.交聯(lián)：方法1. 將膜夾于兩張濾紙之間，在80℃真空烘烤0.5～2小時(shí);方法2. 將膜置于一可透過紫外線的塑料保鮮膜中，將有RNA的一面朝下，用紫外透射儀照射合適時(shí)間。帶正電荷的尼龍膜適度照射可促進(jìn)RNA上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)雜交信號(hào)。但過度照射確會(huì)使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共價(jià)結(jié)合于尼龍膜表面，導(dǎo)致雜交信號(hào)減弱。

對(duì)于濕潤的尼龍膜，總照射劑量為1.5 J/cm2，而干燥尼龍膜總照射劑量為0.15 J/cm2。

9.轉(zhuǎn)膜效果檢測(cè)：如果需要，可對(duì)轉(zhuǎn)移上RNA的膜進(jìn)行染色檢查轉(zhuǎn)膜效果。將交聯(lián)后的膜浸入5%冰醋酸中，于室溫浸泡15min.，elisa定量檢測(cè)試劑盒再將膜轉(zhuǎn)移至亞甲藍(lán)染液中，室溫下浸泡5～10min.?？梢娒黠@的5s和18s兩條RNA帶，mRNA呈現(xiàn)模糊帶型。