1、取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。
2、膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。
3、灌膠：將有機(jī)托盤放入制膠模具上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。將瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠*凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。
4、加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。
5、電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在60-80V,電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿約2cm時,停止電泳。
6、染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。
7、觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩,以免損傷眼睛。經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6,曝光時間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。