1 ．利用PCR從預(yù)制的丸GTll文庫中制備cDNA插入片段：pG6質(zhì)粒是為帶有多聚T核苷酸的cDNA進(jìn)行方向性克隆而設(shè)計的。利用帶有各自閱讀框的三個載體，每個cDNA都有可能被正確翻譯，直到核糖體遇到終止密碼子。考慮到許多蛋白分子的裝配，采用隨機(jī)引物法來構(gòu)建cDNA文庫可能對克隆相互作用更適合。事實上，不是全長蛋白而是功能區(qū)，特別是細(xì)胞質(zhì)的功能區(qū)對無毒性的及作為pⅥ融合的表達(dá)起著更重要的作用。然而，在理想條件下，在這些載體中對用隨機(jī)引物法構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行克隆必須要求在每個載體的N021位點后，在每個閱讀框內(nèi)有翻譯終止子的引導(dǎo)區(qū)。而且，只有50%的轉(zhuǎn)化子在正確的表達(dá)位點上包含了cDNA 片段。

利用PCR從已制備的cDNA文庫中制備大量的cDNA 片段，用來構(gòu)建gⅥ-cDNA噬菌體顆粒文庫。盡管描述了從一個已制備的、SfiI-NotIλ入GTll方向性克隆的cDNA文庫中擴(kuò)增的cDNA 片段，但是這更適合于從使用適當(dāng)載體引物的其他文庫中擴(kuò)增cDNA 片段，這個引物包含了酶SfiI和酶NotI的限制位點。建立一個大容量的gⅥ-cDNA文庫需要有十個同一的PCR反應(yīng)。盡管提供一個特殊的方法很難，但從經(jīng)驗上來說，哺乳動物的cDNA文庫由5×105～1×106個獨立的克隆組成，從系統(tǒng)學(xué)上說，這些克隆至少包含每個mRNA的一個拷貝。模板cDNA文庫應(yīng)該如實地把序列、序列大小以及產(chǎn)生它的mRNA數(shù)量的復(fù)雜程度呈現(xiàn)出來，這是很重要的一面。為了增加DNA合成的保真度，我們*使用具有3’到5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

擴(kuò)增的DNA純化后，用Sfi和NotI進(jìn)行消化，除去小片段的cDNA，用0．8%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳來分離消化的cDNA 片段。另一方面，這些短的片段選擇性地插入到文庫中，并減少文庫中長cDNA克隆基因的數(shù)量。從瓊脂糖薄片上純化DNA并借用商業(yè)可行的系統(tǒng)可以恢復(fù)和濃縮靶cDNA（大小在500～3000bp）。

2．連接與轉(zhuǎn)化：擴(kuò)增的cDNA 片段連接到pG6質(zhì)粒上，為了確定優(yōu)化條件，在腳注中描述了連接測試。另外，為了增加轉(zhuǎn)化效率，建議純化連接混合物。近年來，電轉(zhuǎn)化法是將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中有效的方法。

3．gⅥ-cDNA文庫的評價及保存
為了確保在eDNA文庫重建過程中篩選出來的陰性結(jié)果不是由技術(shù)失誤造成的，因此檢驗文庫的質(zhì)量是十分有必要的，建議要決定好獨立文庫克隆的數(shù)量、片段基因克隆的比例、片段平均長度及它的長度范圍。更加嚴(yán)格的質(zhì)量控制的方法是隨機(jī)抽取10個克隆，對每個cDNA片段從5’端至3’端測序，然后利用BLASTN數(shù)據(jù)庫來分析獲得的序列。