[方法]
1.在2m1的PBS2M緩沖液中打散2mg*磁珠(200ul)并在室溫下旋轉(zhuǎn)機中孵育l小時,再用PBST沖洗磁珠3次。
2.將2.5×1012TU的cDNA噬菌體文庫(大概要準備250ml噬菌體文庫)和用250ul PBS4M打散后的1mg磁珠混合,然后在室溫旋轉(zhuǎn)機中孵育l小時,這一步要盡可能多地除去與*結(jié)合的噬菌體顆粒。
3.用收集器收集磁珠,將上清液轉(zhuǎn)移到新的微離心管中,加*誘餌(后濃度為250mmol/L)并在4℃旋轉(zhuǎn)機中孵育3小時。
4.加1mg磁珠(*步準備好的)到噬菌體+誘餌混合物中并在4℃旋轉(zhuǎn)機中孵育30分鐘。
5.用收集器收集磁珠,用PBST沖洗磁珠10次,根據(jù)收集器將微離心機設(shè)置為瞬時離心以維持磁珠在微離心管的底部。
6.(a)在0.5ml的PBS和50mmol/L的DTT溶液中打散磁珠以便抽提噬菌體顆粒,在室溫下孵育10分鐘,然后用收集器收集磁珠并將上清液轉(zhuǎn)移到一新的微離心管中,在冰浴中保存溶液。(b)另一方面,在400ul 0.1mol/L*—HCl,pH 2.2溶液中打散磁珠,再在室溫下孵育10分鐘,然后用收集器收集磁珠并將上清液轉(zhuǎn)移到一新的微離心管中,加100ul 1mol/LTris—HClpH 8.0的溶液來中和該溶液,后在冰浴中保存溶液。7.將一半抽提出來的噬菌體(250ul)加10ml平板*0F,細胞中⑧,在37℃孵育30分鐘。
8.取一等份感受態(tài)培養(yǎng)細胞(100ul),連續(xù)稀釋然后將它們涂抹在LBAT平板上,37℃過夜孵育后計克隆數(shù)。
9.在20℃,2500g旋轉(zhuǎn)剩余的感受態(tài)培養(yǎng)細胞10分鐘,除去上清液,然后在LBAT溶液中打散細胞顆粒,每一平方平板涂抹1m1細胞懸浮液,在37℃過夜孵育平板。
10.獲得并儲存選擇出的克隆,如果還需做進一步的選擇,可以在裝有1 OD600細胞(8×108個細胞)的100m1搖瓶中接種20ml LBAT,并對噬菌體顆粒進行獲取和純化處理。