實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性*定量方法，已得到的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
?
參數(shù)規(guī)格：
產(chǎn)品名稱：創(chuàng)傷弧菌核酸檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品規(guī)格：50T
產(chǎn)品貨號(hào)：FS-P9881
產(chǎn)品分類：熒光PCR法
產(chǎn)品運(yùn)輸：低溫運(yùn)輸
儲(chǔ)存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
運(yùn)輸：低溫、避光，快遞免費(fèi)送貨上門。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
本產(chǎn)品就是根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物而開發(fā)的高靈敏 PCR檢測(cè)試劑盒 。
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟 
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）    1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
定量PCR方法：
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競爭模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。
PCR的反應(yīng)條件：
因擴(kuò)增片段的大小、反應(yīng)體積、使用擴(kuò)增儀器的不同而不同。
◇ 循環(huán)次數(shù)
根據(jù)模板DNA的量以及擴(kuò)增片段的大小，設(shè)定25～30個(gè)循環(huán)。
如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，則會(huì)出現(xiàn)Smear。
◇ Anneal以及Extension
合適的Anneal溫度通常在45～68℃之間 (預(yù)備實(shí)驗(yàn)可2℃間隔進(jìn)行)。另外，由于在60～68℃間，也有很高的活性, 因此可在此溫度范圍內(nèi)設(shè)定Anneal-Extension溫度, 進(jìn)行2 Step PCR。Anneal-Extension溫度為68℃ 時(shí)，每kbp大體可設(shè)定30秒～1分鐘；當(dāng)溫度設(shè)定在68℃以下時(shí), 時(shí)間設(shè)定可稍長一些。通常，Anneal溫度太高，有時(shí)會(huì)得不到擴(kuò)增產(chǎn)物；Anneal溫度太低時(shí)，容易發(fā)生非特異性反應(yīng)。另外，Extension時(shí)間太短時(shí)，會(huì)得不到擴(kuò)增產(chǎn)物或者會(huì)有一些短的非特異性產(chǎn)物優(yōu)成；而Extension時(shí)間太長時(shí)，會(huì)出現(xiàn)Smear。
rrTNF-a, CF (10 UG)名稱: 人食管癌；NEC RPMI1640(w/oHepes)10%FBS

rrTNF-a (50 UG)名稱: 人膀胱鱗癌；SCaBER MEM-EBSS:MinimumEssentialMedium(MEMEagleswithEarle'sBalancedSalts)10%FBS；1%NEAA,1mM丙鈉

rrTNF-a (10 UG)名稱: 人肺鱗癌；SK-MES-1 MEM-EBSS:MinimumEssentialMedium(MEMEagleswithEarle'sBalancedSalts)10%FBS

rRTN1-A MAb (Cl 559706) (100 UG)名稱: 小鼠胚胎成纖維；PA317 DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)10%FBS

rrTIMP-1, CF (10 UG)名稱: 人胚胎胰腺組織來源；CCC-HPE-2 DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)20%FBS

rrTIM-1, CF (50 UG)名稱: 人神經(jīng)上皮瘤；SK-N-MC MEM-EBSS:MinimumEssentialMedium(MEMEagleswithEarle'sBalancedSalts)10%FBS

rrTie-2/Fc, CF (100 UG)名稱: 人導(dǎo)管癌；T47D[T-47D] RPMI1640(w/oHepes)10%FBS；0.2Units/ml牛胰島素

rrROBO1/Fc, CF (50 UG)名稱: 人橫紋肌肉瘤；TE671SublineNo.2 DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)10%FBS

rrRAGE/Fc, CF (50 UG)名稱: 人甲狀腺鱗癌；SW579[SW579；SW-579] L15:LeibovitzMedium10%FBS

rrPTX2/SAP, CF (50 UG)名稱: 人膠質(zhì)瘤；TJ905 DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)10%FBS

rrPTX2/SAP (50 UG)名稱: 人髓樣甲狀腺腫瘤；TT F12K10%FBS

rrProlactin R/Fc, CF (50 UG)名稱: 熒光素酶轉(zhuǎn)染人成骨肉瘤；U2OS-LucteT-on DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)10%Tetsystem提供的胎牛血清；200μg/mlG418

rrPDGF-BB, CF (50 UG)名稱: 人涎腺腺樣囊性癌；ACC-2 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS

rrPDGF-BB (50 UG)名稱: 人原位胰腺腺癌；BxPC-3 DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)10%FBS

rrPDGF-AB, CF (10 UG)名稱: 人視網(wǎng)膜母瘤；Y79 RPMI1640(w/oHepes)20%FBS

rrPDGF-AA, CF (50 UG)名稱: 小鼠結(jié)腸癌；CT26.WT[CT26WT] RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
創(chuàng)傷弧菌核酸檢測(cè)試劑盒人1,3-二磷甘油(1,3-DPG)ELISA試劑盒iNOSELISAKIT產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人胱天蛋白酶激活的脫氧核糖核酶(CAD)ELISA試劑盒iNOSELISAKIT產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人蛋白聚糖(PG)ELISA試劑盒iNOSELISAKIT產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人蛋白酶3抗體(PR3Ab)ELISA試劑盒INSELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)ELISA試劑盒INSELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人泛素結(jié)合酶(E2/UBCE)ELISA試劑盒INSELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人對(duì)環(huán)磷酰胺(CTX)ELISA試劑盒INSELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人多巴色素異構(gòu)酶(DT)ELISA試劑盒INSELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。