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貨號(hào)	FS-X10394

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱(chēng)：Porcupine抑制劑(LGK974)

英文名稱(chēng)：LGK974

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg

貨號(hào)：FS-X10394

產(chǎn)品介紹:

英文名稱(chēng)：LGK974

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg

LGK974是一種有效的特異性的Porcupine(PORCN)抑制劑，也有效抑制Wnt信號(hào)通路，IC50為0.4nM。

注：本品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號(hào)：1243244-14-5

純度：98.97%

分子量：396.44

儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請(qǐng)盡量在一個(gè)月內(nèi)使用。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

栗疫菌眼部白化病相關(guān)蛋白OA1/蛋白偶聯(lián)受體143抗體Anti-ABCG2 Antibody多萜長(zhǎng)二磷寡糖蛋白環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移(DDOST/OST-48)

腐生葡萄球菌癌基因蛋白抑瘤M抗體Anti-ABCG2 Antibody多肽YY(Peptide-YY)

豇豆慢生根瘤菌卵巢癌相關(guān)基因2蛋白抗體Anti-ABCG2 Antibody(PB0380)多免疫球蛋白受體(poly-IgR)

大腸埃希氏菌跨膜蛋白Orai2抗體Anti-ABCG5 Antibody多聚血清蛋白(PHSA)

耶爾森氏菌耳聾、常染色體隱性遺傳22抗體Anti-ABCG5 Antibody多聚腺二磷核糖聚合(PARP)

水稻節(jié)桿菌1號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框80抗體Anti-ABCG8 Antibody多聚ADP核糖聚合(PARP)

云芝栓孔菌（變色栓菌）寡腺合成-1Anti-ABCG4 Antibody多功能蛋白聚糖(VS)

山綠豆根瘤菌KLHDC9蛋白抗體Anti-ABHD5 Antibody(PB1073)多功能蛋白聚糖(versican)

海陳文新氏菌少突膠質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子3抗體Anti-ABI1 Antibody多巴色異構(gòu)(DT)

葡萄座腔菌螺旋轉(zhuǎn)錄因子OTP抗體Anti-ABCG8 Antibody多巴脫羧(DDC)

總狀毛霉小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌膜通道蛋白抗體Anti-ABI1 Antibody(PB0459)多巴-β羥化(DBH)

大腸埃希菌緊密連接蛋白/小分子膠原蛋白OCEL1抗體Anti-ABL1 Antibody多巴D2受體(D2R)

根瘤菌富含脯突觸相關(guān)蛋白SHANK3抗體Anti-ABI2 Antibody多巴D1受體(D1R)

鮑魚(yú)側(cè)耳癌調(diào)蛋白/癌鈣蛋白抗體Anti-ABL2 Antibody多巴(DA)

樹(shù)舌靈芝少突髓磷脂糖蛋白抗體Anti-ABL2 Antibody(PB0959)對(duì)氧磷-3(PON3)

Magnivallibacter阿片樣物質(zhì)結(jié)合蛋白/粘附分子樣蛋白抗體Anti-ABR Antibody對(duì)氧磷(PON)

海綿假單胞菌Pseudomonas│pachastrellae 質(zhì)量規(guī)格：>15Units/mg protein

豌豆根瘤菌Rhizobium│leguminosarum 質(zhì)量規(guī)格：>98.5%,合物,BR

蒙氏假單胞菌Pseudomonas│monteilii Elomari et al. 質(zhì)量規(guī)格：>99%
Porcupine抑制劑(LGK974)小葉相思根瘤 7--6-硝基-4-羥基喹唑啉肌激B型

克魯斯假絲酵母 4-溴-3-甲雌受體β

別氏不動(dòng)桿 4-(2-)吡啶5-羥色1A

香菇碳銫5-羥色2A

香菇鹽聯(lián)氨5-羥色2C

異配囊接霉 1-溴-2-甲基丁烷5-羥色3A

黑曲霉 1,2,4-苯三5-羥色3B

大轉(zhuǎn)基因成分（陽(yáng)性） 4,4'-二甲氧基二苯二硫5-羥色4A

毛木耳雜6 4-硫基-1H-吡啶并[3，4-d]嘧啶5-羥色6A

蘇云金桿武漢亞種 3,3'-Dipropylthiacarbocyanine iodide囊泡單轉(zhuǎn)運(yùn)體

地衣芽孢桿 6-氨基苯并噻唑單氧化A

糞產(chǎn)堿桿 6-溴喹啉犬尿氨基轉(zhuǎn)移

地衣芽孢桿 5-氨基-2-氟苯肌球蛋白輕鏈磷

赤霉屬 2-氨基-3-苯甲肌球蛋白輕鏈磷

雙歧雙歧桿 2,6-二氟-4-羥基苯甲蛋白激C
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)