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貨號	FS-X9825

產(chǎn)品介紹:

細(xì)胞凋亡時產(chǎn)生顯著的變化是染色體固縮，DNA 裂解使細(xì)胞核形態(tài)產(chǎn)發(fā)生變化。本試劑盒提供的熒光染料Hoechst 33258 是一種無毒、水溶性雙苯咪唑類化合物，可作為熒光探針與DNA 分子結(jié)合。

在凋亡細(xì)胞中，細(xì)胞膜對Hoechst 33258 的攝取增高，并且由于染色體高度濃縮，Hoechst 33258 與之結(jié)合增強(qiáng)，染色呈強(qiáng)藍(lán)色熒光，而正常細(xì)胞只呈微弱熒光，死細(xì)胞則不被染色，由此可檢測出凋亡。

操作方法

1. 用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡；

2. 用冷Buffer A 洗滌細(xì)胞二次，離心收集106 細(xì)胞于1.5mL 微量離心管中；（貼壁細(xì)胞原位固定染色）

3. 加入1mL 的4%溶液(用戶自備)，4℃固定細(xì)胞10min；

4. 離心去固定液，用Buffer A 洗兩遍；離心后留50～100μL Buffer A 重懸細(xì)胞；

5. 取上步驟50～100μL 細(xì)胞懸液涂片，自然晾干；

6. 滴加100μL Hoechst 33258 工作液（備注1），室溫染色10 min，水沖凈晾干；

7. 以紫外光340nm 波長激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察。

儲存：2-8℃，避光，有效期一年。

中文名稱：Hoechst33258染色試劑盒

英文名稱：Apoptotic Cell Hoechst 33258 Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：100T

貨號：FS-X9825

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

B-細(xì)胞κ-輕肽基因增強(qiáng)子抑制因子激β(IκBKβ)英文名：IκBKβ 胃癌多藥耐藥相關(guān)蛋白包裝5g

B-淋巴細(xì)胞趨化因子1(BLC1)英文名：BLC1 酪蛋白激casein kinase Iα抗體包裝1g

B-淋巴細(xì)胞激活抗原B7-2(LAB7-2)英文名：LAB7-2 磷化酪蛋白激casein kinase Iα抗體包裝1g

BMP結(jié)合內(nèi)皮調(diào)節(jié)因子(BMPER)英文名：BMPER 磷化酪蛋白激casein kinase Iα抗體包裝5g

BH3相互作用域死亡激動劑(Bid)英文名：Bid 肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白CAPG抗體包裝5MG

Bcl2相關(guān)髓細(xì)胞白血病序列1(MCL1)英文名：MCL1 Ⅰ型膠原/1型膠原a1抗體包裝100mg

Bcl2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)英文名：Bax Ⅲ型膠原蛋白/膠原蛋白3/3型膠原蛋白抗體包裝25mg

A類清道夫受體3(SCARA3)英文名：SCARA3 CD96抗體包裝1g

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2(ABCG2)英文名：ABCG2 貓眼綜合征染色體候選基因2抗體包裝25g

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白C6(ABCC6)英文名：ABCC6 1號染色體開放閱讀框146抗體包裝5g

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ABCA1)英文名：ABCA1 1號染色體開放閱讀框150抗體包裝100g

Apelin13蛋白(AP13)英文名：AP13 1號染色體開放閱讀框156抗體包裝25g

Apelin12蛋白(AP12)英文名：AP12 1號染色體開放閱讀框159抗體包裝5g

Apelin蛋白(APLN)英文名：APLN 1號染色體開放閱讀框162抗體包裝5mg

AMPA離子能谷受體4(GRIA4)英文名：GRIA4 1號染色體開放閱讀框163抗體包裝1g

解脂耶羅威亞酵母Yarrowia│lipolytica 質(zhì)量規(guī)格：>98.5%,BR 乙酰酯試劑盒洋川芎內(nèi)酯I;Senkyunolide

刺黑烏霉菌Memnoniella│echinata 質(zhì)量規(guī)格：HPLC>98%,標(biāo)準(zhǔn)品乙酰受體抗體試劑盒洋川芎內(nèi)酯H;Senkyunolide

秦氏蜜環(huán)菌Armillaria│qinii H.C. Wang & J. Zhao 質(zhì)量規(guī)格：含量960~1030µg/mg,USP30乙酰試劑盒洋川芎內(nèi)酯A;Senkyunolide
Hoechst33258染色試劑盒沙門氏馬凝集試驗抗原 5-氨基-3-甲基-1-苯基吡唑卵清蛋白

枯草芽孢桿 2-溴-3-甲氧基苯高遷移率族蛋白B1-IgG抗體

蘇云金芽孢桿庫爾斯塔克亞種 3-, 98+%高遷移率族蛋白B1-IgM抗體

產(chǎn)克雷伯氏 1-環(huán)基-6,7-二氟-1,4-二氫-8-甲氧基-4-氧代-3-喹啉羧高遷移率族蛋白B1-IgA抗體

果生鏈核盤 (2R,3S)-(-)-N-叔丁氧羰基-6-氧代-2,3-二苯基嗎啉抗卵巢抗體

香栓 2-辛基-2H-苯并三唑抗心磷脂抗體

栗疫 2-溴咪唑并[1,2-a]吡啶肝結(jié)合

鴨疫里氏桿 Boc-DL-色白介1受體

空泡單胞 5-乙?；?2(1H)-吡啶酮氨基?；?

糞生黑蛋巢 4-乙氧基鹽鹽死骨片1

普利茅斯沙雷氏 2,3-二氟-4-基苯CD90分子

孟氏假單胞 4-磺酰杯[4]芳烴水合物胰蛋白

畢赤酵母 5-溴-2-氟苯JAGGED1蛋白

漢遜德巴利酵母 N-[(1R)-2-[3-(氨基磺酰基)-4-甲氧基]-1-甲基乙基]乙酰視黃1

香矛假單胞 1-吡唑甲蛋白C抑制物

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