PCR的反應(yīng)條件：
因擴增片段的大小、反應(yīng)體積、使用擴增儀器的不同而不同。
◇ 循環(huán)次數(shù)
根據(jù)模板DNA的量以及擴增片段的大小，設(shè)定25～30個循環(huán)。
如果循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，則會出現(xiàn)Smear。
◇ Anneal以及Extension
合適的Anneal溫度通常在45～68℃之間 (預(yù)備實驗可2℃間隔進行)。另外，由于在60～68℃間，也有很高的活性, 因此可在此溫度范圍內(nèi)設(shè)定Anneal-Extension溫度, 進行2 Step PCR。Anneal-Extension溫度為68℃ 時，每kbp大體可設(shè)定30秒～1分鐘；當(dāng)溫度設(shè)定在68℃以下時, 時間設(shè)定可稍長一些。通常，Anneal溫度太高，有時會得不到擴增產(chǎn)物；Anneal溫度太低時，容易發(fā)生非特異性反應(yīng)。另外，Extension時間太短時，會得不到擴增產(chǎn)物或者會有一些短的非特異性產(chǎn)物優(yōu)成；而Extension時間太長時，會出現(xiàn)Smear。
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參數(shù)規(guī)格：
產(chǎn)品名稱：水泡性口炎病毒核酸檢測試劑盒
產(chǎn)品規(guī)格：50T
產(chǎn)品貨號：FS-P10113
產(chǎn)品分類：熒光PCR法
產(chǎn)品運輸：低溫運輸
儲存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
運輸：低溫、避光，快遞免費送貨上門。
產(chǎn)品特點：
本產(chǎn)品就是根據(jù)保守區(qū)設(shè)計引物而開發(fā)的高靈敏 PCR檢測試劑盒 。
實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟 
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）    1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
定量PCR方法：
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。
實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性*定量方法，已得到的*，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr, te ..名稱: 人腎透明癌；UT14 10%FBS

Tetrahymena tropicalis Nanney and McCoy名稱: 人腎透明癌；UT16 10%FBS

Homo sapiens, human skin, foreskin名稱: 人腎透明癌；UT48 10%FBS

Serpula lacrymans (Wulfen : Fries) Schroeter名稱: 人腎透明癌；UT44 10%FBS

Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hans ..名稱: 螢光素酶標(biāo)記的人結(jié)直腸癌；HCT116-LUC-28 DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)10%FBS+200ug/mlHygromycin

Candida albicans (Robin) Berkhout名稱: 人腎透明癌；UT33a 10%FBS

Homo sapiens, human名稱: 螢光素酶-紅色熒光蛋白標(biāo)記的人癌；MDA-MB-231-Luc2-tdT RPMI1640(w/oHepes)10%FBS+200ug/mlG418

Mycosylva setosa Udagawa et Furuya名稱: 缺氧誘導(dǎo)的綠色熒光蛋白標(biāo)記的人癌；MCF7-hiGFP-12C DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)10%FBS+200ug/mlG418

Eremothecium coryli (Peglion) Kurtzman名稱: 缺氧誘導(dǎo)的綠色熒光蛋白標(biāo)記的人癌；MCF7-hiGFP-130C DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)10%FBS+200ug/mlG418

Campylobacter jejuni subsp.jejuni (Jones ..名稱: 螢光素酶標(biāo)記的人結(jié)直腸癌；HCT116-LUC-22 DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)10%FBS+200ug/mlHygromycin

Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hans ..名稱: 缺氧誘導(dǎo)的綠色熒光蛋白標(biāo)記的人癌；MDA-MB-231-hiGFP-5C RPMI1640(w/oHepes)10%FBS+200ug/mlG418

Ustilago maydis (DeCandolle) Corda, teleomo ..名稱: 缺氧誘導(dǎo)的綠色熒光蛋白標(biāo)記的人癌；MDA-MB-231-hiGFP-10C RPMI1640(w/oHepes)10%FBS+200ug/mlG418

Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) Migula名稱: 缺氧誘導(dǎo)的綠色熒光蛋白標(biāo)記的小鼠癌；Ca761-hiGFP-3C DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)5%FBS+200ug/mlG418

Stagonospora gigaspora (Niessl) Saccardo名稱: 缺氧誘導(dǎo)的綠色熒光蛋白標(biāo)記的小鼠癌；Ca761-hiGFP-1C2 DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)5%FBS+200ug/mlG418

Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hans ..名稱: 表達人性成纖維生長因子的人癌；MCF7-bFGF-EGFP DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)10%FBS

Homo sapiens, human名稱: 表達人性成纖維生長因子的小鼠癌；Ca761-bFGF-EGFP DMEM-H:Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium(DMEH-214.5g/LiterGlucose)10%FBS
水泡性口炎病毒核酸檢測試劑盒人神經(jīng)保護因子(CVNPF)ELISA試劑盒TRAILR4ELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人神經(jīng)細胞粘附分子配體1(NCAM-L1/CD171)ELISA試劑盒TRAIL-R4ELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人抗補體1q抗體(C1q)ELISA試劑盒TRELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人細胞素(CTX)ELISA試劑盒TRELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人細胞性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4/CD152)ELISA試劑盒TRELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人殺菌性/通透性增加蛋白(BPI)ELISA試劑盒TRELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人利鉀尿肽(KP)ELISA試劑盒TRELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

人血清素/血清胺(ST)ELISA試劑盒TREM-1ELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。