膠原酶III型-上海撫生實(shí)業(yè)有限公司

貨號(hào)	FS-X9753

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱：膠原酶III型

英文名稱：Collagenase III

產(chǎn)品規(guī)格：100mg

貨號(hào)：FS-X9753

產(chǎn)品介紹:

本品為III型膠原酶，≥100 U/mg solid，常用于乳腺細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的制備。

本品來(lái)源于溶組織梭菌（Clostridium histolyticum），是一種酶粗提物，不僅含有膠原酶（更準(zhǔn)確的稱法為梭菌蛋白酶A（clostridiopeptidase A）），能夠降解天然膠原和網(wǎng)狀纖維。還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等，分別能夠有效水解結(jié)締組織和上皮組織細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白，多糖和脂質(zhì)，使得本品非常適用于組織消化。

膠原酶（Collagenase）是一種蛋白酶，一種肽鏈內(nèi)切酶，能夠特異性的識(shí)別Pro-X-Gly-Pro序列（該序列高頻率出現(xiàn)在膠原中，很少發(fā)現(xiàn)于其他蛋白中）并切割該序列中性氨基酸（X）和甘氨（Gly）之間的肽鍵。許多蛋白酶都能水解單鏈且變性的膠原多肽，但膠原酶是一種可以降解具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維的蛋白酶，這種膠原纖維廣泛存在結(jié)締組織內(nèi)。

目前商業(yè)化提供的細(xì)菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異，分為四種類型：膠原酶I型，II型，III型和IV型，在應(yīng)用上有所偏向：

1）膠原酶I（Type I Collagenase）：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白活性）。通常用作上皮細(xì)胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的制備；

2）膠原酶II（Type II Collagenase）：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來(lái)源細(xì)胞的制備；

3）膠原酶III（Type III Collagenase）：含有較低的蛋白酶活性，常用于乳腺細(xì)胞的制備；

4）膠原酶IV（Type IV Collagenase）：含有低活性，通常用于胰島細(xì)胞的制備，或者需要維持受體完整性的細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)。

分子量：68-130 kDa

激活劑：Ca2+、Zn2+

抑制劑：EDTA, EGTA,Cysteine, histidine, 2-mercaptoethanol, o-phenanthroline DTT, Hg2+, Pb2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Not inhibited by DFP or serum

活力單位：在37℃，pH7.5 的條件下，5h內(nèi)水解膠原產(chǎn)生相當(dāng)于1μM L-亮氨的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

儲(chǔ)存條件：4℃避光，有效期兩年

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

著絲粒蛋白H(CENPH)英文名：CENPH 癌相關(guān)蛋白2抗體包裝100g

粘蛋白5B(MUC5B)英文名：MUC5B 癌抗雌激耐藥蛋白1包裝25g

粘蛋白5AC(MUC5AC)英文名：MUC5AC 胞漿支鏈基轉(zhuǎn)抗體包裝500g

粘蛋白4(MUC4)英文名：MUC4 磷化癌抗雌激耐藥蛋白1抗體包裝1g

粘蛋白2(MUC2)英文名：MUC2 促凋亡調(diào)節(jié)蛋白BNIP3抗體包裝250mg

粘蛋白1(MUC1)英文名：MUC1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白2受體抗體包裝5g

早期生長(zhǎng)應(yīng)答因子4(EGR4)英文名：EGR4 狀腺激受體共激活蛋白抗體包裝1g

早期生長(zhǎng)應(yīng)答因子2(EGR2)英文名：EGR2 磷化促凋亡Bik蛋白抗體包裝100mg

早期生長(zhǎng)應(yīng)答因子1(EGR1)英文名：EGR1 蛋白酪激BAP135抗體包裝1g

再生胰島衍生蛋白3γ(REG3γ)英文名：REG3γ 磷化相關(guān)死亡促進(jìn)因子抗體包裝5g

再生胰島衍生蛋白3α(REG3α)英文名：REG3α 磷化Bax抗體包裝1g

再生胰島衍生蛋白1β(REG1β)英文名：REG1β Bcl-10抗體包裝25g

載脂蛋白H(APOH)英文名：APOH 原癌基因Bcl-6抗體包裝5g

載脂蛋白F(APOF)英文名：APOF 磷化Bcl-10抗體包裝100g

載脂蛋白E(APOE)英文名：APOE 磷化死亡調(diào)解子抗體包裝25g

整合樣金屬蛋白與凝血樣2蛋白抗體肌肉生長(zhǎng)抑制(MSTN)PRT-060318 (PRT318)是新穎選擇性的酪激 (Syk) 抑制劑， IC50值為4 nM。
膠原酶III型蟹枝毛殼 5,6,7,8-四氫-8-羥基喹啉上皮黏附分子

矮小傘枝霉 4--3-神經(jīng)

蘇云金芽胞桿多窩亞種 5-甲基尿甙神經(jīng)膠質(zhì)纖維性蛋白

陰溝腸桿 4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮神經(jīng)節(jié)脂M3抗體

埋藏曲霉 1-乙基環(huán)戊神經(jīng)生長(zhǎng)導(dǎo)向因子

異常漢遜酵母 (3AR,7AS)-REL-八氫-1H-異鹽鹽神經(jīng)生長(zhǎng)因子

泛枝芽孢桿 3--2-羧神經(jīng)絲蛋白

野蘑菇二甲硫烷神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白1

多根硬皮馬勃月桂鋰神經(jīng)肽A

相思根瘤埃索美拉唑鈉神經(jīng)肽B

乳桿屬 4,4-二甲氧基丁神經(jīng)肽Y

枯草芽胞桿 2,3,4-三氟苯甲神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1

豬輪狀病 3-(三氟乙酰基)神經(jīng)粘附分子1

谷棒桿 1-N-Cbz-4-基神經(jīng)酰

釀酒酵母甲磺己酯神經(jīng)型一氧化氮合成
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)