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貨號	FS-X11062

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時；

4．將經(jīng)過計數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。

中文名稱：EGFR抑制劑(Pelitinib)

英文名稱：Pelitinib

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg

貨號：FS-X11062

產(chǎn)品介紹:

Pelitinib(EKB-569;WAY-EKB569)是可逆的EGFR抑制劑，IC50值為38.5nM。也可輕微抑制Src，MEK/ERK和ErbB2，IC50值分別為282，800，和1255nM。

注：本品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號：257933-82-7

別名：EKB-569;WAY-EKB 569

純度：98.65%

分子量：467.92

儲存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請盡量在一個月內(nèi)使用。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

扭轉(zhuǎn)蛋白B抗體 Torsin B

轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)節(jié)蛋白1抗體 TCERG1

巴爾得-別德爾綜合征相關(guān)蛋白8抗體 TTC8

味覺受體蛋白家族2亞基7抗體 TAS2R7

味覺受體蛋白家族2亞基50抗體 T2R50

扭轉(zhuǎn)原腸胚形成同源蛋白1抗體 TWSG1

Tuftsin蛋白抗體 Tuftsin

跨膜蛋白161A抗體 TMEM161A

腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8抗體 TNFAIP8

TBC結(jié)構(gòu)域TBCD4蛋白抗體 TBCD4

宮頸癌原癌基因8抗體 TTC23

腫瘤壞死因子受體相互作用蛋白抗體 TRIP
EGFR抑制劑(Pelitinib)暗鱗白鬼傘 Oleoside

多源中間根瘤 Raucaffricine

豬丹絲 Ohchinin

灰樹花GF-5 O-Demethylforbexanthone

林生毛霉 Obtucarbamate A

佐氏庫特氏 Protoplumericin A

枯草芽孢桿 Oblongine

施氏假單胞 Ocotillone

短雙歧桿 Nigrolineaxanthone V

變幻青霉（可訂）蕊木堿甲酯

尖孢鐮孢辛夷烯酮

大單孢屬 Borapetoside B

白腐盾殼霉（葡萄白腐?。?/span> 紫背金牛

水犧黃桿 Aglaxiflorin D

Chryseobacterium 粗毛羊藿
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)