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貨號(hào)	FS-X10710

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

中文名稱(chēng)：I型P21激活激酶(PAK)抑制劑(FRAX597)

英文名稱(chēng)：FRAX597

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg

貨號(hào)：FS-X10710

產(chǎn)品介紹:

FRAX597是一種有效的I型P21激活激酶(PAK)抑制劑，作用于PAK1，2和3，IC50分別為8，13和19nM。

注：本品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他用途！

號(hào)：1286739-19-2

純度：99.19%

分子量：558.1

儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期2年，溶入溶劑后-20℃請(qǐng)盡量在一個(gè)月內(nèi)使用。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

立形乳桿菌GATA結(jié)合蛋白3抗原Anti-CLIP4 Antibody人胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子(TARC/CCL17)

蘋(píng)果黑腐皮殼菌GATA結(jié)合蛋白4抗原Anti-CLK1 Antibody人胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子(TARC/CCL17)

木耳987生長(zhǎng)終止特異性同源盒基因抗原Anti-CLK4 Antibody人神經(jīng)粘附分子配體1(NCAM-L1/CD171)

青霉屬生長(zhǎng)分化因子8抗原Anti-CLN5 Antibody人神經(jīng)粘附分子配體1(NCAM-L1/CD171)

茯苓*膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子抗原Anti-CLN5 Antibody人神經(jīng)保護(hù)因子(CVNPF)

枯草芽孢桿菌凝溶膠蛋白抗原Anti-CLN6 Antibody人神經(jīng)保護(hù)因子(CVNPF)

螺卷毛殼綠色熒光蛋白Anti-CLNS1A Antibody人可溶性腫瘤壞死因子α受體(sTNFαR)

奇異球菌綠色熒光蛋白Anti-CLPTM1 Antibody人可溶性腫瘤壞死因子α受體(sTNFαR)

大豆慢生根瘤菌糖皮質(zhì)激誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體抗原Anti-CMKLR1 Antibody人可溶性因子受體(sCKR)

釀酒酵母下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1蛋白抗原Anti-CMPK1 Antibody人可溶性因子受體(sCKR)

地衣芽孢桿菌胰高血糖樣肽-1（多肽）Anti-CMTM1 Antibody人可溶性凋亡相關(guān)因子配體(sFASL)

血紅鞘單胞菌胰高血糖樣肽-1（多肽）Anti-CMTM1 Antibody人可溶性凋亡相關(guān)因子配體(sFASL)

大腸埃希菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3抗原Anti-CMTM2 Antibody人凋亡抑制因子(IAP)

德?tīng)柌加墟呓湍噶?/span>-巨噬克激因子抗原Anti-CMTM2 Antibody人凋亡抑制因子(IAP)

竹喙球菌糖蛋白A33(跨膜)抗原Anti-CMTM4 Antibody人集落激因子(CSF)

敏捷食菌磷脂?；鞍拙厶?/span>-1抗原Anti-CMTM3 Antibody人集落激因子(CSF)

蛋白體PSMα3抗體施氏假單胞菌人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞

蛋白體PSMD3抗體枯草芽孢桿菌人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞

腦蛋白4抗體褐球固氮菌小鼠皮膚黑色瘤細(xì)胞

蛋白體PRS7抗體巨大芽孢桿菌人乳腺癌細(xì)胞（綠色熒光蛋白標(biāo)記）
I型P21激活激酶(PAK)抑制劑(FRAX597)德?tīng)柌加墟邎A酵母 2'-氨基苯乙酮粒集落激因子

檸檬色節(jié)桿二甲硝咪唑磷脂A2

絮邊蘑菇三(2-呋喃基)膦鱗狀癌相關(guān)抗原

運(yùn)動(dòng)節(jié)桿 D-阿洛酮糖硫類(lèi)肝

稀褶乳菇 2，6-二氟芐卵巢癌抗原

大腸埃希 2,6-二氟苯球蛋白A

布魯氏病全乳環(huán)狀反應(yīng)抗原球蛋白E

枯草芽孢桿 1,2-環(huán)己烷二甲二縮水甘油酯球蛋白G

釀酒酵母 DL-2,3-二氨基鹽鹽球蛋白M

澳大利亞平臍蠕孢變色2B腦鈉;腦鈉尿肽

燕麥?zhǔn)任鞴蟻喎N* 三氟磺鐿內(nèi)皮

谷棒桿Ⅰ型 1,3-二苯基異苯并呋喃內(nèi)皮1

飼料類(lèi)芽胞桿 4--2-吡啶甲凝聚

松木青霉 2--3-硝基吡啶凝血抗凝血復(fù)合物

南海芽孢桿 3-氨基-6-噠凝血原片段F1+2
操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)